脐血源树突状细胞促进T细胞对 肿瘤细胞的杀伤效应
作者：曲新栋 曲政海，左建新，孙立荣
【摘要】 本研究探讨人脐血单个核细胞体外诱导分化的树突状细胞（DC）促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。 利用淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取脐血单个核细胞，经贴壁法获得脐血贴壁的单个核细胞，经粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF）、白介素?4（IL?4）体外诱导分化为脐血DC。用间接免疫荧光法检测DC，MTT法检测DC活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。试验组加DC, DC与肿瘤细胞的比例分别为20∶1、50∶1、100∶1，对照组不加DC。结果表明： 脐血单个核细胞经GM?CSF、IL?4诱导后，第15天在倒置显微镜下可见典型形态的DC。荧光显微镜下，CD1a+细胞率为（43.12±5.83）%。各实验组与对照组比较，实验组DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应均高于对照组，差别均具有显著性（P＜0.01）。100∶1组与50∶1组比较，对肿瘤细胞的杀伤效应差别无统计学意义（P＞0.05）；100∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组，差别有统计学意义（P＜0.05）；50∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组，差别有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 人脐血单个核细胞体外经细胞因子诱导分化培养的DC可促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。
【关键词】 脐血单个核细胞 树突状细胞 肿瘤细胞 免疫功能
Enhancing Effect of Dendritic Cells Derived from Human Cord Blood on T Cells in Killing Tumor Cells
Abstract Dendritic cells (DCs) derived from bone marrow cells are specialized cells for the uptake, processing, and presentation of foreign and self?antigens. The study indicated that re?transfusion of DCs pulsed with tumor?associated antigen can induce an vigorous specific anti?tumor response in clinic. The present study was aimed to investigate the enhancing effect of DCs derived from human cord blood on T cells in killing tumor cells. Human cord blood mononuclear cells were isolated from human cord blood by density gradient centrifugation using lymphocyte separating medium, and cord blood mononuclear cells were obtained by adherence and cultured in a liquid culture system with GM?CSF and IL?4 for 15 days. Then the cells were analyzed for phenotypes of CD1a by indirect immunofluorescence. The capacity of DCs to initiate T cell?dependent anti?tumor immune responses was assayed by MTT kit. The ratios of DCs to tumor cells in experimental groups were 20∶1,50∶1 and 100∶1 respectively. The DCs were not added in control group. The results indicated that in the presence of GM?CSF and IL?4, the DCs with typical morphological features at days 15 were observed. At that time, (43.12±5.83)% CD1a+ cells were obtained. In addition to these phenotypic properties, the DC of experimental groups could remarkably initiate T cell?dependent anti?tumor immune responses with different ratios compared with control group ( P＜0.01)， there were no significant difference of killing effects between 100∶1 and 50∶1 groups (P＞0.05), and killing effect of DC in 20∶1 group was higher than that in 100∶1 or 50∶1 groups (P＜0.05). It is concluded that human cord blood mononuclear cells can serve as a better source of DC, which can promote the capacity to initiate T cell?dependent anti?tumor immune responses.
Key words cord blood； mononuclear cell； dendritic cell； tumor cell； immune function
J Exp Hematol 2007; 15(3):586-590
树突状细胞（DC）具有强大的抗原呈递和处理功能，已成为恶性肿瘤免疫关注的焦点。本研究旨在探讨人脐血单个核细胞在GM?CSF、IL?4等细胞因子作用下体外诱导分化的DC对人肿瘤细胞 的杀伤效应及其机制，为恶性肿瘤的免疫治疗提供新的理论依据。
主要器材
3111型CO2培养箱（美国Forma Scientific公司产品）,24孔细胞培养板（美国Costar公司产品）,IX?70型倒置显微镜（日本Olympus公司产品）,BH?2型荧光显微镜（日本Olympus公司产品）, SW?CJ?1F型净化工作台（苏州净化设备厂公司产品）, -80℃低温冰箱（美国Forma Scientific公司产品）,550型酶标仪（美国Bio?Rad公司产品）。
主要试剂
神经母细胞瘤细胞株SK?N?SH由院上海生命科学研究院提供,RPMI 1640培养液和胎牛血清购自Hyclone公司, Ficoll淋巴细胞分离液（相对密度1.077）购自中国医学科学院生物工程研究所,重组人白细胞介素?4（rhIL?4）购自美国Promega公司,重组人粒?巨噬细胞集落刺激因子（rhGM?CSF）购自哈尔滨医药集团生物工程有限公司,鼠抗人CD1a单克隆抗体和FITC标记的兔抗鼠IgG均购自协和干细胞基因工程有限公司。
标本采集
脐血取自青岛大学医学院附属产科健康足月顺产新生儿。
脐血单个核细胞（CBMNC）的制备［1］
肝素钠抗凝的脐血5 ml，加入5 ml RPMI 1640培养液等体积稀释。将稀释脐血以3∶1沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液上面。 1500×g离心20分钟。离心后上层与中层交界处混浊的灰白色层即为单个核细胞层。用尖头滴管轻轻插入灰白色层，吸出该层的单个核细胞。将RPMI 1640培养液加入Ep管中混匀单个核细胞悬液， 13 300×g离心5分钟,弃去上清，重复洗涤2次。用RPMI 1640培养液调整单个核细胞悬液浓度为1×107/ml，分成2份，其中1份用作于DC的诱导分化，另1份用作于T细胞的分离。
DC的诱导分化
取24孔培养板，每孔加入1 ×107单个核细胞，终体积为2 ml。37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中孵育3小时。轻摇培养板，吸弃细胞悬液，洗去非黏附细胞，获得黏附细胞。加入含rhGM?CSF终浓度为100 ng/ml，rhIL?4终浓度为100 ng/ml的RPMI 1640培养液2 ml，于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养15天。第7天半量换液，补充细胞因子至原浓度，第15天收获， 13 300×g离心5分钟，弃去上清，获得沉淀细胞。用RPMI 1640培养液调整不同的细胞浓度以备用。
DC的鉴定
采用间接免疫荧光法鉴定DC。加入鼠抗人CD1a抗体（一抗）50 μl，混匀，4℃孵育过夜。 用PBS洗涤2次，加入FITC标记的兔抗鼠抗体（二抗）50 μl，混匀，4℃孵育30分钟。以PBS洗涤2次,取1滴细胞悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片。在荧光显微镜下先用普通透射光计数视野中的单个核细胞，然后用紫外光计数同一视野中的荧光阳性细胞，DC的百分率。
T细胞的尼龙棉柱法分离
将0.5 ml单个核细胞悬液加入尼龙棉柱内，平放尼龙棉柱，以滴管伸入柱内近尼龙棉界面，滴加0.2 ml预温至37℃的含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液后封口，平置于37℃温箱中孵育30分钟，用预温至37℃的上述溶液5-10 ml洗柱,再用20-25 ml上述溶液充分洗去残留的T细胞，洗下的悬液即为分离的T细胞。
T细胞的冻存及复苏
将T细胞悬液750×g离心5分钟,弃去上清。向沉淀物中加入由1份DMSO和9份RPMI 1640培养液配制而成的冻存液，使细胞密度为1×107/ml。先将冻存管放在4℃冰箱45分钟,然后置于-20℃ 60分钟，最后将冻存管投入液氮中保存。恒温水浴箱温度调至37℃。从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃温水中快速晃动，直至冻存液完全溶解。将冻存T细胞悬液移入离心管中，加入5 ml RPMI 1640培养液，轻轻吹打均匀。将细胞悬液750×g离心5分钟,弃去上清。向细胞沉淀物中加入培养液，轻轻吹打均匀，调整到所需的浓度备用。
肿瘤细胞的培养
本实验采用神经母细胞瘤细胞作为靶细胞。神经母细胞瘤细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁生长，每6-7天传代1次。传代时，用滴管吸弃培养液，用PBS洗涤1次，加入2.5％胰酶，37℃培养箱中消化3-5分钟，用倒置显微镜观察细胞消化的情况，待细胞回缩变圆，加入培养液中止消化，用滴管轻轻吹打，使贴壁的细胞从瓶壁充分游离下来，形成细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中， 750×g离心5分钟，弃去上清，用RPMI 1640培养液调整细胞的浓度。实验时取对数生长期细胞。用0.1%台盼蓝拒染法鉴定活性在98%以上。
DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应
以RPMI 1640培养液调整T细胞浓度为1×106/ml,调整肿瘤细胞浓度为1×104/ml。实验组加DC、1×106T细胞及1×104 肿瘤细胞，终体积为2.5 ml。对照组不加DC，对照组加1×106T细胞及1×104 肿瘤细胞，终体积也为2.5 ml。实验组分别按DC∶肿瘤细胞=20∶1,50∶1,100∶1的比例加入DC，即分别加入DC 2×105 ，5×105，1×106。实验组及对照组另设单独效应细胞孔及单独靶细胞孔，以计算杀伤效应。37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养48小时，加入MTT（使其终浓度为0.5 mg/ml）,继续孵育4小时,终止培养， 750×g离心5分钟后弃去上清，每孔加入DMSO 150 μl，37℃振荡溶解5分钟，于酶标仪570 nm处读取OD值，按下列公式计算杀伤效应：
杀伤效应(%)=［1 -（试验孔OD值-效应细胞孔OD值）/靶细胞孔OD值）］×100%
统计学处理
采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。实验数据以±SD表示，采用配对资料的t检验， P＜0.01为差异有显著统计学意义，P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
DC诱导分化过程中形态学观察
脐血单个核细胞在体外诱导培养的初期倒置显微镜下可见多数圆形贴壁细胞，加入细胞因子GM?CSF、IL?4第3天起逐渐开始悬浮,至第5天,大部分细胞已悬浮,部分细胞表面在10×40倒置显微镜下可见有突起状毛刺。在第15天,60%以上的细胞胞体变大(至少为小淋巴细胞的3-4倍),外形不规则,呈梭形或不规则外形,表面毛刺明显增多,呈现典型的DC形态（图1）。
Figure 1. DC morphology shown by inverted microscopy after incubation with GM?CSF and IL?4 for 15 days in vitro (×400).
CD1a+细胞率
脐血单个核细胞体外经GM?CSF和IL?4诱导分化15天，在荧光显微镜下先用普通透射光计数视野中的细胞，然后用紫外光计数上述同一视野中的强荧光细胞，CD1a+强阳性表达的细胞占收获的细胞的（43.12±5.83）%（图2）。
Figure 2. DC morphology shown by fluorescence microscopy using FITC labeled CD1a antibody after being cultured for 15 days （×400）.
DC对肿瘤细胞的杀伤效应
加DC的实验组分别与不加DC的对照组比较，实验组DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应均高于对照组，差别具有显著性意义（P＜0.01）。100∶1组与50∶1组比较，对肿瘤细胞的杀伤效应差别无统计学意义（P＞0.05）；100∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组，差别有统计学意义（P＜0.05）；50∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组，差别有统计学意义（P＜0.05）。
讨 论
DC是目前所知的机体内功能最强的，也是惟一可以激活初始T细胞的专职性抗原呈递细胞,是机体免疫应答的始动者，其在肿瘤免疫中扮演着重要的角色。
如何在短时间内获得足够数量的DC是深入研究DC生物学特性、功能和临床应用的前提和关键。多年来人们一直在探索获取DC的有效方法，包括最初的从含有DC的组织（如皮肤、扁桃体及外周血等）中通过密度梯度离心获取DC，以及目前从脐血、骨髓、动员的外周血的单个核细胞或CD34+造血干细胞,甚至从血液系统肿瘤细胞培养获得DC。脐血DC仅占脐血单个核细胞的（0.16±0.12）%［2］，外周血DC也仅占外周血单个核细胞的0.1%-1.0%［3］，因此直接从脐血或外周血分离获取DC效率低。由于脐血相对容易获得，脐血单个核细胞对各种造血因子反应、增殖与分化能力强，且在相同条件下脐血单个核细胞来源的DC与CD34+细胞来源的DC具有相同的功能，这些因素提示人脐血单个核细胞可能是一个可以大量获取DC的理想来源［4］。
本研究采用淋巴细胞分离液密度梯度离心脐血，获得脐血单个核细胞，然后脐血单个核细胞经贴附法，获得脐血贴壁的脐血单个核细胞，经GM?CSF、IL?4体外诱导分化为脐血DC。单个核细胞被认为是DC 和巨噬细胞的共同前体,GM?CSF的主要作用是使单个核细胞向DC和巨噬细胞分化。IL?4的作用是抑制巨噬细胞的生成，使更多的单个核细胞分化成为DC，从而提高脐血单个核细胞转化DC的效率［5］。此外,有报道TNF可促进DC的成熟［6］。
目前国内外鉴定DC采用的主要表面标志为CD1a分子。本研究采用单克隆抗体间接免疫荧光法检测表达CD1a的DC，CD1a阳性细胞率为（43.12±5.83）%。CD1a主要表达于未成熟的DC［7］。有资料显示,未成熟的DC对肿瘤细胞的杀伤活性是成熟的DC的3-4倍［8］。
本研究采用尼龙棉柱法从脐血单个核细胞中分离T细胞，该法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。也可采用免疫磁珠法分离T细胞。
为尽量避免异基因混合淋巴细胞反应，提高DC的抗肿瘤效应，与其他学者的实验有所不同的是，本实验中诱导分化的DC和分离的T细胞均来自同一个个体的脐血。因为DC的体外诱导分化需要15天左右，要做到诱导分化的DC和分离的T细胞均来自同一个个体，这就涉及到T细胞的保存及存活问题，我们采用T细胞冻存复苏的方法保存T细胞，结果T细胞的存活率均达95%以上，证实了上述方法的可行性。
随着手术、化疗和造血干细胞移植工作的广泛开展，恶性肿瘤患儿的中位生存期已经明显延长。但是，传统化疗只能使肿瘤细胞呈对数级下降，治愈肿瘤疾病最终需依靠患儿机体自身免疫细胞发挥功能，这一领域的研究正在飞速，已经给肿瘤疾病的带来了新的理论和策略。
DC因其强大的抗原呈递功能，已成为恶性肿瘤免疫治疗关注的焦点［9-11］。DC作为最重要的抗原呈递细胞负载肿瘤抗原后,可以激发机体抗肿瘤免疫反应。利用其抗原呈递功能所进行的树突状细胞疗法在许多恶性肿瘤的实验性治疗中取得了令人鼓舞的疗效。经肿瘤抗原冲击致敏的DC,回输患儿体内可以抑制同种肿瘤生长［12］，如B 淋巴细胞瘤［13］、多发性骨髓瘤和黑色素瘤等。肿瘤抗原负载DC的方法有以下几种：肿瘤抗原、DC和T细胞共同培养；肿瘤溶解抗原负载DC；编码肿瘤抗原的mRNA转染DC。
本研究采用肿瘤全细胞抗原负载脐血DC，脐血DC通过脐血T细胞进而发挥杀伤肿瘤细胞的效应。试验结果表明，加DC的实验组能显著提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，与对照组比较，差别具有显著性意义(P＜0.01)。为了探讨DC的数量与T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应的关系，我们分别按照DC与肿瘤细胞不同的比例100∶1，50∶1，20∶1设计实验组，结果为，100∶1组与50∶1组比较，对肿瘤细胞的杀伤效应差别无统计学意义（P＞0.05）；100∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组，差别有统计学意义（P＜0.05）；50∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组，差别有统计学意义（P＜0.05）。这些结果提示树突状细胞增强抗肿瘤效应可能存在最适合的浓度，浓度增大，杀伤效应不一定增强，其确切机制尚不清楚，推测可能与T细胞耗竭有关。
肿瘤细胞作为内源性抗原，通过MHCⅠ类途径被DC呈递给T细胞。T细胞可能通过以下机制发挥杀伤肿瘤细胞的效应：①T细胞活化后大量表达FasL(配体)，FasL和肿瘤细胞表面的Fas分子（受体）结合，通过Fas分子胞内段的死亡结构域，激活caspase 8，再激活一系列caspase，引起死亡信号的逐级转导，最终激活内源性DNA内切酶，使核小体断裂，并导致细胞结构损毁，细胞死亡。②T细胞释放颗粒溶解素，通过穿孔素形成的孔道进入肿瘤细胞，引起肿瘤细胞的溶解。
检测细胞杀伤效应的方法有形态学观察、放射性同位素法（51Cr释放试验）、乳酸脱氢酶释放法、MTT（四噻唑蓝）法和流式细胞术等。本研究采用MTT法。MTT法是检测细胞存活的间接方法［14］。此法的基本原理是活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）能将外源性的MTT的四氮唑盐还原成为不可溶性的紫色结晶物formazan并沉积在细胞中， formazan被二甲亚砜（DMSO）溶解后所呈现的色度（用OD值表示）反映出活细胞的数量和代谢水平。死亡细胞则无此酶活性，OD值低代表细胞线粒体内SDH将MTT转化为甲臜的能力低，细胞活性低，细胞存活数量少，效应细胞杀伤效应高。
目前国内外已发现，DC 也具有一定程度的不依赖T细胞的杀伤肿瘤细胞的功能。DC与肿瘤细胞系作用后肿瘤细胞出现凋亡现象［15］ ,故诱导细胞凋亡被认为是DC杀伤肿瘤细胞的一个重要机制。TNFα相关的凋亡诱导配体(TRAIL) 是TNF 家族中新型凋亡分子［16］, 它的天然受体在多种肿瘤细胞上均有表达，能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡，它对机体正常组织不具有明显的毒性作用,只选择性地杀伤肿瘤细胞或转化细胞,由于这个特点,它目前在肿瘤免疫研究中倍受关注。因此根据TRAIL 的生物学特点,我们设想DC是否能够通过增加自身TRAIL的表达直接诱导肿瘤细胞的凋亡，这有待于我们进一步研究。
人脐血单个核细胞在体外经细胞因子rhGM?CSF和rhIL?4诱导分化培养，可生成大量的DC。DC体外可促进T细胞对人肿瘤细胞的杀伤效应。
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