p53对缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞演变的影响

                   作者：李开龙, 杜晓兰, 宋瑞华, 赵玲, 何娅妮, 张建国  陈林

【关键词】  缺血再灌注;,肾小管上皮细胞;,衰老;,凋亡;,p53

　　　[Abstract]  AIM: To observe the variation of renal tubular epithelial cells in p53（+/+） and p53（/）mice with young or old age at different time after kidney ischemia/reperfusion injury (IRI), and to investigate the  contribution of p53 gene in the variation. METHODS: p53（+/+） and p53(/) male mice at age of 2 and 12 months were made ischemic by clamping left renal hila for 45 min. At 0, 1, 3 and 7 d,   1, 3 and 6 month after reflow, renal tissues were processed for morphometric observation and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）, apoptosis and senescenceassociated βgalactosidase (SAβgal) analysis, using hematoxylin and eosin stain, immunohistochemistry, terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTPbiotin in situ nickend labeling (TUNEL) and histochemical staining, respectively. RESULTS: Renal tubule necrosis was more severely in p53(/) mice and aged mice compared to p53（+/+） mice and young mice (P<0.05), respectively. Apoptotic cells in p53（+/+） mice increased obviously compared to p53(/) mice (P<0.05) at 7 d after IRI.  In young wildtype mice, occasionally faint staining for SAβgal activity began to appear at 1 month, and obviously significantly increased at 3 and 6 months after IRI (P<0.05), but in contralateral kidney at any time as mentioned above, and in the IRI kidneys in p53(/) mice at 1 and 3 months, there  was almost no positive staining for SAβgal; occasionally positive staining for SAβgal was observed in the IRI kidney in p53(/) mice at 6 months after IRI. In p53 (/) and p53（+/+） aged mice, both kindeys had positive staining for SAβgal activity at 0d after IRI, but the level of the activity in p53(/) mice was much more lower than that in p53(+/+) mice (P<0.05), then the level of the activity  decreased notably at 1d in the IRI kidney (P<0.05). Positive stain of nuclear PCNA in p53（+/+） young mice had no statistical significance compared to p53（+/+） aged mice (P>0.05). But in p53(/) mice, significant positive staining for PCNA was tested, especially in young mice and in IRI kidneys(P<0.05). Correlation analysis between senescent and apoptotic cells in aged mice was made at 1d after IRI, then striking negative correlation was found between both of them in p53（+/+） mice (r=-0.82, P<0.05), but no statistical correlation in p53(/) mice（r=0.26, P>0.05）. CONCLUSION: IRI can accelerate renal tubular cell senescence and cellular death（both necrosis and apoptosis）after that. p53 gene  may play an important role in the variation of tubular epithelial cells after kidney IRI.

　　[Keywords]ischemia/reperfusion; renal tubular epithelial cell; senescence; apoptosis; p53

　　[摘 要]  目的: 观察缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury, IRI）后, 低龄和高龄p53（+/+）和p53（/）鼠肾小管上皮细胞的演变, 探讨p53基因对IRI后肾小管上皮细胞演变的影响。方法: 分别建立低龄（2月龄）和高龄（12月龄）p53（+/+）和p53（/）鼠左肾IRI模型。于IRI后0 d、 1 d、 3 d、 7 d、 1月、 3月、 6月, 用HE染色观察肾小管组织学变化, 免疫组织化学法检测肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表达, 组织化学染色观察肾小管上皮细胞衰老相关β半乳糖苷酶（SAβgal）的活性, 用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTPbiotin in situ nickend labeling, TUNEL)法检测肾小管上皮细胞凋亡。结果: IRI后0d, 肾小管以坏死为主, 高龄鼠比低龄鼠明显(P<0.05), p53(/)鼠比p53（+/+）鼠明显(P<0.05); 细胞凋亡在7 d时达到高峰, 且高龄鼠比低龄鼠明显（P<0.05）, p53（+/+）鼠比p53(/)鼠明显（P<0.05）。p53（+/+）低龄鼠IRI后1月出现衰老细胞, 3月和6月显著增多（P<0.05）, 对侧肾未见衰老细胞; 而p53(/)低龄鼠IRI后6月才出现明显的衰老细胞; 两种基因型高龄鼠在IRI后0 d双肾均见衰老细胞, 但p53（+/+）鼠显著多于p53(/)鼠（P<005）, 1 d后, IRI肾的衰老细胞明显减少（P<0.05）, 对侧肾无变化。p53（+/+）高龄和低龄鼠细胞增殖无统计学意义（P>0.05）, 而p53(/)低龄和高龄鼠在IRI后3、 7 d细胞增殖进行性增加, 且低龄鼠显著多于高龄鼠、 p53(/)鼠多于p53（+/+）鼠（P<005）。对高龄鼠IRI后1 d点细胞衰老和凋亡进行相关分析显示, 在p53（+/+）鼠二者显著负相关（r=-082, P<005）, 在p53（/）鼠, 二者无显著相关性（r=026,  P>005）。结论: ①IRI可促进正常肾小管上皮细胞衰老的进程; ②已经进入衰老状态的肾小管上皮细胞在遭受IRI刺激后, 更易走向死亡（坏死和/或凋亡）; ③p53在IRI所致肾小管上皮细胞演变过程中发挥着重要的调控作用。

　　[关键词]缺血再灌注; 肾小管上皮细胞; 衰老; 凋亡; p53
   
　　1960年, Hayflick发现培养的正常人成纤维细胞在经过一定的增殖期后最终分裂停止, 这种不可逆的细胞增殖停止被称为细胞衰老。一般认为, 衰老是细胞对各种应激适应性反应的一种表现形式, 这些应激包括氧化应激、 DNA损伤、 端粒缩短、 某些致癌基因的激活以及某些肿瘤抑制基因的过度表达等[1, 2]。长期增殖后的细胞, 在外源性应激的刺激下, 可能触发细胞衰老的内在机制, 使细胞快速出现衰老, 有时甚至于在应激后数天内发生。这种由于外源性刺激引起的细胞衰老被称为复制衰老（replicative senescence）[3]。老化机体肾脏组织学和功能的恶化与肾小管上皮细胞衰老有着直接的关系。应激因素和肾小管上皮细胞衰老之间的相互作用可能是老年人群发生肾功能不全的重要原因之一, 衰老细胞在应激刺激下可能更易于发生坏死和/或凋亡[1, 3, 4]。有证据表明, p53对细胞衰老和凋亡具有重要的调控作用[2, 5]。本研究旨在探讨p53对缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞衰老演变的影响, 丰富衰老相关性肾病和/或肾功能不全的发生机制, 为其防治提供新的理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  p53（/）和C57鼠从美国NIH引进, 在我院野战外科研究所实验动物中心（符合国家SPF级实验动物标准）饲养和进行同系繁殖。p53（/）鼠与C57鼠杂交后获得p53杂合子鼠, 雄性p53（+/）鼠和雌性p53（+/）交配后获得雄性实验用鼠140只。其中低龄（2月龄）p53（+/+）、 低龄p53（/）、 高龄(12月龄) p53（+/+）和高龄p53（/）鼠分别为35只。低龄和高龄p53（+/+）鼠平均体质量为21.62±4.05 g和32.2±8.66 g, 低龄和高龄p53（/）鼠平均体质量为24.23±6.40 g和37.5±8.28 g。衰老相关β半乳糖苷酶染色试剂盒购自SIGMA公司, ApoAlert DNA片段检测试剂盒购自BD公司, 鼠抗PCNA单克隆抗体(mAb)和荧光素标记的山羊抗鼠IgG购自CHEMICON公司; 冰冻切片机为Laica公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物模型和组织标本的制作  （1）动物模型的建立: 参照Supavekin 等[6]的方法建立小鼠单侧肾脏 IRI模型。腹腔注射25/L的阿伏丁（AVERTIN, 0.016 mL/g体质量）麻醉小鼠, 无菌条件下左背侧纵形切口1.5 cm入腹腔, 游离出左侧肾蒂, 无创动脉夹阻断血流45 min, 开放动脉夹, 观察肾脏恢复灌注后关闭腹腔, 建成IRI模型。低龄p53（+/+）和p53（/）鼠、 高龄p53（+/+）和p53（/）鼠四组动物（每组35只）, 分别在IRI后0、 1、 3和7 d以及1、 3和6月各处死5只收集肾脏标本。（2）标本制作: 麻醉小鼠后, 腹部正中切口入腹腔, 离断腹主动脉充分放血处死动物, 收集双肾, 剥离肾包膜, 称量双肾重量, 矢状纵行剖开肾脏, 用含DEPC的PBS冲洗肾脏1 min后, 一半肾组织经丙酮固定、 蔗糖脱水后作冰冻切片（厚4 μm）, 置-70℃冰箱冻存, 作组织化学染色、 免疫组化和免疫荧光检测; 另一半肾组织经40 g/L多聚甲醛固定后作石蜡包埋HE染色。

　　1.2.2  观察内容、检测指标及检测方法  （1）肾组织HE染色一般组织学观察: 参照参Megyesi等的方法稍作改进。HE染色, 光镜下观察IRI后肾小管坏死的变化, 将肾小管坏死分为0～3级: 0级-无坏死; 1级-坏死局限在皮质的1/3范围内, 主要在近曲小管的S3段; 2级-坏死超出皮质的2/3范围; 3级-坏死波及皮质全层。（2）肾组织小管上皮细胞凋亡、 增殖、 衰老检测: 均采用冰冻切片（厚4 μm）。①凋亡: TUNEL法, 采用ApoAlert DNA 片段检测试剂盒, 按操作手册进行。荧光显微镜下观察, 在520±20 nm波长下凋亡细胞胞核染成强的绿色荧光, 620 nm观察所有细胞胞质染成红色。②增殖: 冰冻切片干燥后, 4℃丙酮固定4    min、 干燥, 经抗原修复、 0.3%H2O2甲醇溶液除出内源性过氧化物酶后, 加鼠抗PCNA mAb（工作浓度1∶100）, 阴性对照加PBS, 室温孵育1 h。冰PBS洗2×10 min, 加荧光素标记的山羊抗鼠IgG（工作浓度1∶50）, 室温孵育1 h, 室温PBS洗2×10 min, 中性树胶封片, 荧光显微镜下观察, 绿色荧光示PCNA阳性。③衰老: 组织化学染色法, 在pH6.0的条件下染色16 h检测衰老相关β半乳糖苷酶（senescenceassociated βgalactosidase, SAβgal）活性, pH7.4的条件下, 所有组织SAβgal活性均为阴性（作为对照）。具体步骤按衰老相关β半乳糖苷酶染色试剂盒按操作手册进行。伊红复染后光学显微镜下观察, 衰老细胞染成靛蓝色或紫兰色。④结果分析: 细胞凋亡、 PCNA和SAβgal染色结果采用半定量计分法: 0分, 无阳性信号出现; 1分, 偶见阳性染色信号; 2分, 局灶性阳性染色信号出现; 3分,   弥漫性阳性染色信号出现。每例标本随机选择10个高倍视野, 平均值作为计量资料。

　　1.2.3  统计学处理  肾小管坏死与细胞凋亡、 增殖和衰老等计量资料均采用SPSS8.0统计软件包进行统计学处理, 结果以x±s表示, 多组资料间和同组多个时点资料间比较, 方差齐者, 采用OneWay ANOVA 分析, 组间两两比较采用LSD 法, 方差不齐者, 采用Tamhane 分析, 对有相关趋势的变量进行线性回归分析。P<0.05为具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  缺血再灌注损伤(IRI)后肾小管病变化  IRI后0 d、 1 d和3 d, 肾小管出现以坏死为主的组织形态学改变, 高龄鼠比低龄鼠严重、 同龄的p53（/）鼠比p53（+/+）鼠严重（P<0.05, 图1）, 7 d后逐渐减轻, 1月后逐渐消失（表1）, 对侧肾在低龄鼠无明显组织学异常。

　　表1  缺血再灌注损伤后肾小管坏死的评估　略

　　2.2  IRI后肾小管上皮细胞凋亡、 衰老和增殖变化  两种基因型鼠在IRI 1 d 后, 肾小管上皮细胞开始出现凋亡, 7 d时达到高峰（P<0.05）, 高龄鼠比低龄鼠明显、 p53（+/+）鼠比p53（/）鼠明显（P<0.05, 图2）。p53（+/+）低龄鼠IRI后1月出现SAβGal染色阳性的衰老细胞, 而对侧肾此时仍未见衰老细胞, 3、 6月后衰老的肾小管上皮细胞显著增多（P<0.05, 图3）; p53（/）低龄鼠IRI肾在3月以前的各时间点时则未见SAβGal染色阳性的肾小管上皮细胞, 6月后衰老的肾小管上皮细胞有增多, 但明显低于同龄和同时间点的p53（+/+）鼠（图3）; 高龄鼠IRI后0 d双肾均见SAβGal染色阳性肾小管上皮细胞, 且p53（+/+）鼠显著多于p53（/）鼠（P<0.05,  图4）, 但在1 d后, IRI肾的衰老细胞都明显减少（P<0.05,    图4）, 1月后衰老细胞又逐渐增多, 只是仍较对侧肾脏少, 但却较同时间点低龄鼠多。PCNA阳性染色细胞出现的频率在p53（+/+）高龄和低龄鼠间没有统计学意义（P>0.05）, 但低龄组细胞增殖能力要强于高龄组（图5）; 在p53（/）鼠, PCNA阳性染色细胞在IRI后3、 7 d进行性增加, 低龄鼠显著多于高龄鼠, 且明显多于同龄和同时间点的野生鼠（P<0.05, 图5, 表2）。

　　2.3  肾小管上皮细胞SAβGal染色阳性信号与TUNEL阳性信号之间的相关性分析  选择高龄鼠IRI后1 d点, 对肾小管上皮细胞SAβGal染色阳性信号与TUNEL阳性信号之间之间进行相关分析, 结果显示: 在p53（+/+）鼠二者显著负相关（r=-0.82, P<0.05）、 而在p53（/）鼠, 二者无统计学意义（r=0.26, P>0.05）。

　　表2  左肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞凋亡、 增殖和衰老变化　略

　　图1 －图5  略

　　3  讨论

　　衰老和衰老相关性疾病过程中的肾脏组织学及功能恶化与肾小管上皮细胞衰老密切相关, 应激可能通过不同的途径加速细胞衰老及其演变[2]。对成纤维细胞衰老机理的研究提示, 应激p53p21Rb（p107/p130）(retinoblastoma, Rb, 视网膜母细胞癌基因产物)激活通路可能在体细胞衰老的发生中产生重要的调控作用, 但p53在应激诱导肾小管上皮细胞衰老中的作用并不清楚。通过对低龄和高龄p53（+/+）和p53（/）鼠单侧肾脏IRI后不同时间点肾小管上皮细胞演变的观察, 我们发现, IRI后0 d, 高龄p53（/）鼠双肾衰老的肾小管上皮细胞明显少于高龄p53（+/+）鼠（P<0.05）, 提示p53基因敲除后肾小管上皮细胞的衰老受到抑制。低龄p53（+/+）鼠左肾在IRI 1月后, 衰老的肾小管上皮细胞进行性增加, 但在低龄p53（/）鼠IRI肾, 衰老的肾小管上皮细胞在IRI后6月才出现, 而且在程度上显著轻于同时间点的p53（+/+）鼠（P<0.05）, 提示p53基因缺乏对IRI诱导肾小管上皮细胞复制衰老的发生也有抑制作用。另一方面, 与p53（+/+）鼠相比, p53（/）鼠IRI后, 早期肾小管坏死和后期肾小管上皮细胞增殖则相对增强, 细胞凋亡的变化则明显受抑（P<0.05）。细胞增殖增多提示在p53缺乏的条件下, 其通过p21对细胞周期的阻滞作用被解除, 结果导致细胞增殖增强和死亡（坏死）加剧; 同时伴随细胞周期阻滞的解除, 细胞凋亡也应该增加, 但我们的结果却发现细胞凋亡反而显著受抑, 可能的解释是: p53是重要的促凋亡基因, 在细胞凋亡的两条主要通路（死亡细胞凋亡通路和线粒体凋亡通路）中均有多功能转录调节子p53的参与[7], 所以在p53缺乏时, IRI诱导的细胞凋亡明显受阻。对高龄鼠的研究发现, IRI后0 d, 双肾均存在较多自然衰老的肾小管上皮细胞, 尤以p53（+/+）高龄鼠明显; IRI后1 d, 这种衰老细胞显著减少。相关分析发现, 在p53（+/+）鼠细胞凋亡和衰老显著负相关（r=-0.82, P<0.05）、 而在p53（/）鼠, 二者无显著相关性（r=0.26, P>0.05）。提示IRI可诱导衰老的肾小管上皮细胞向凋亡转化, p53缺乏也可使这种转化受抑。应激诱导衰老细胞凋亡可能与半胱天冬酶3的激活或表达上调有关[4], 死亡受体凋亡通路和线粒体凋亡通路最终都通过激活caspase3(共同通路)进入细胞凋亡的执行阶段, 而p53又是这两条细胞凋亡通路的重要参与者。所以p53可能参与了IRI诱导衰老肾小管上皮细胞凋亡的调控过程。应激诱导细胞演变的机制极其复杂, 初步研究表明, 多功能转录调节子p53在细胞衰老的发生和维持中起着枢纽作用, 是调节凋亡反应和衰老反应的关键因子[1, 2, 5]。Bond 和Rogan等发现野生型p53功能的丧失足以引起成纤维细胞逃避衰老, 另有作者则发现, p53功能的激活伴随出现成纤维细胞衰老复制; p53功能亢进的小鼠寿命均有一定的缩短[8], 并且出现多种早老征象, 从这些小鼠机体获得的细胞在应激培养条件下更易发生衰老和凋亡。激活的p53是如何促成细胞衰老, 机制不明。有意义的是, 应激状态下, p53和p21可能通过对细胞周期的调节促成细胞衰老[2], p21通过与p53的结合, 能够激活p21转录[9]。研究发现, 培养的成纤维细胞在复制到达极期的时候, p21基因的表达呈数倍增加, p53功能丧失废止了p21的表达, 从而使处于生长停止状态的成纤维细胞发生逆转。因此推测细胞复制衰老的发生可能与应激p53p21Rb（p107/p130）通路激活有关[2]。同时, p53又是重要的促凋亡基因, 它是细胞凋亡两条主要通路的重要参与者[5]。我们的研究发现, 小鼠p53缺乏, 对肾小管上皮细胞自然衰老和复制衰老的发生均有显著的抑制作用, 也使IRI诱导正常肾小管上皮细胞凋亡和衰老显著减轻, 细胞增殖和坏死则相对增强和加剧。首次从遗传学角度证实p53对小鼠肾小管上皮细胞衰老及其演变具有重要的调控作用。总之, 我们的研究结果提示, IRI可促进正常肾小管上皮细胞衰老的进程; 衰老的肾小管上皮细胞在遭受IRI刺激后, 更易走向死亡（坏死和/或凋亡）; p53在IRI所致肾小管上皮细胞演变过程中发挥着重要的调控作用。有效调节p53的表达对于防止IRI引起的肾脏急、 慢性损伤可能具有积极意义。

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