ST6Gal I 基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

                    作者：苑天红, 李明远, 李婉宜, 李虹, 蒋忠华

【关键词】  siRNA;,结肠肿瘤;,唾液酸转移酶;,黏附;,肿瘤侵袭力

　　EffectofST6GalIsiRNAmediatedgene silencing on the adhesion and invasion of SW480 cells

　　[Abstract]AIM: To study the effect of synthesized ST6Gal I specific siRNA on the adhesion and invasiveness of human colon carcinoma cell line SW480 with over expression of ST6Gal I. METHODS: A double strand small interference RNA (siRNA) targeting ST6Gal I was designed and synthesized, and then transfected into SW480 cells by lipofectmine 2000. SW480 cells were cultured and divided into 4 groups: blank control group, liposome control group, nonspecific siRNA group and ST6Gal I siRNA group. The expression of ST6Gal I mRNA was examined by RTPCR and the amount of α2,6sialylation on the SW480 cell surface was detected by flow cytometry. The adhesion and invasion of SW480 cells to extracellular matrix (ECM) were analyzed by using CytoMatrixTM kit and cell invasion assay kit, respectively. RESULTS: After SW480 cells were transfected for 48 hours, the expression of ST6Gal I mRNA in ST6Gal I siRNA group was significantly decreased compared with that in the blank control group, liposome control group, and nonspecific siRNA group (P<0.05). After SW480 cells were transfected  for 72 hours, the amount of α2,6sialylation on cell surface, the adhesion and invasion of the cells in ST6Gal I siRNA group were markedly lower than those in the other 3 groups (P<0.05). CONCLUSION: The chemically synthesized specific siRNA targeting ST6Gal I can effectively inhibit the expression of  ST6Gal I  and reduce cell adhesion and invasion to ECM in SW480 cells. Our research is important for further study of antitumor treatment with RNA interference.

　　[Keywords]siRNA; colon neoplasm; sialyltransferase; adhesion; neoplasm invasion

　　[摘 要]  目的: 探讨人α2,6唾液酸转移酶(ST6Gal I)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6Gal I高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法: 设计并合成ST6Gal I靶向的siRNA, 用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、 脂质体对照组、 非特异性siRNA组和ST6Gal I siRNA组, 采用RTPCR测定细胞中ST6Gal I mRNA表达水平, 流式细胞术检测细胞表面α2,6唾液酸含量, 并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒, 检测细胞对细胞外基质（ECM）黏附与侵袭力。结果: 与空白对照组、 脂质体对照组、 非特异性siRNA组相比, 转染48 h后, ST6Gal I siRNA组细胞中ST6Gal I mRNA表达明显下调; 转染72 h后, ST6Gal I siRNA组细胞表面α2,6唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P<0.05)。结论: 化学合成的靶向ST6Gal I的siRNA能够下调SW480细胞中ST6Gal I基因的表达, 降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤奠定基础。

　　[关键词]siRNA; 结肠肿瘤; 唾液酸转移酶; 黏附; 肿瘤侵袭力
   
　　结肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一, 早期侵袭转移是结肠癌患者死亡的主要原因。肿瘤细胞的转移与细胞表面糖复合物的异常表达特别是与糖复合物末端的唾液酸化改变密切相关。α2,6唾液酸转移酶(ST6Gal I)可催化活化的唾液酸以α2,6糖苷键的形式连接到细胞膜表面的N乙酰乳糖胺上, 成为肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)之间相互识别的重要受体[1]。有研究表明, 某些肿瘤细胞如宫颈癌细胞、 乳腺癌细胞、 肝癌细胞、 结肠癌细胞、 胃癌细胞中, ST6Gal I基因均高表达, 由此认为该基因的高表达是引起肿瘤高侵袭力的主要原因之一[1-5]。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是近年研究基因表达调控的热点课题之一, 在抗肿瘤和抗病毒等方面均表现出高度特异性和有效性的抑制作用[6]。本研究中通过探讨ST6Gal I靶向的小分子干扰RNA（small interference RNA, siRNA）对结肠癌细胞表面唾液酸化的抑制作用, 以及降低癌细胞对ECM黏附和侵袭的作用, 为抑制肿瘤转移探索新的治疗方法。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  SW480细胞株购自典型培养物保藏中心。RPMI1640、   OptiMEM培养基干粉购自美国Gibico公司; Trizol试剂、 转染剂脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司; 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的接骨木凝集素（SNA）购自美国Vector公司; RTPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司; CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒均为美国Chemicon公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  siRNA的设计及合成  根据GenBank提供的ST6Gal I基因序列（序列号: X_17247）, 利用Ambion公司网站上交互式软件在线设计了一对siRNA。将其进行BLAST分析, 该siRNA仅与目的基因完全同源, 无非特异靶序列。同时, 设计一对非特异性siRNA(错配siRNA)作为无义对照。所有siRNA由上海吉玛制药技术有限公司化学合成（表1）。

　　1.2.2引物的设计及合成  参照[1]并用primer premier 3.0软件在线设计了一对扩增ST6Gal I的引物, 同时设计了管家基因βactin引物作为内参照（表1）。

　　表1  ST6Gal I干扰序列和RTPCR引物序列　略

　　1.2.3  SW480细胞培养  SW480细胞常规培养于含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液中, 37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养; 每2 d用2.5 g/L胰酶消化传代, 取对数生长期的SW480细胞进行转染。

　　1.2.4siRNA转染将3×105个细胞/(孔・2 mL)接种于6孔培养板中, 当细胞覆盖达60%~80%时进行转染。转染时用不含抗生素的OptiMEM培养液, 将siRNALipofectamine 2000复合体（复合体的配制及转染程序按说明书操作）加到培养板中, 转染体积为500 μL, siRNAs终浓度为50 nmol/L, 以非特异性siRNA组（SW480细胞用对照siRNALipofectamine 2000复合体处理）、 脂质体组(SW480细胞用等量脂质体处理)、 空白组(SW480细胞用等量培养液处理)作为对照。每组设3个复孔, 实验重复进行3次。

　　1.2.5  RTPCR检测细胞中ST6Gal I mRNA的表达水平  SW480细胞被转染48 h后, 细胞总RNA提取用Trizol试剂, 按照说明书方法进行提取。将mRNA反转录为稳定的cDNA, 再进行PCR反应,扩增ST6Gal I和内参照βactin, 扩增片段长度分别为379 bp及622 bp。PCR反应条件参见文献[1]: 94℃ 1 min, 59℃ 1 min 10 s, 72℃ 2 min, 共27个循环, 最后再于72℃ 延伸10 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭显色, 紫外成像仪下观察, Gene Genius凝胶成像分析系统测定灰度值, 以ST6Gal I与βactin灰度值的比值来反映ST6Gal I mRNA的表达量, 比值越高说明目的基因表达越高。

　　1.2.6  流式细胞术（FCM）检测细胞表面α2,6唾液酸含量SW480细胞被转染72 h后, PBS漂洗各组细胞, 与特异性识别α2,6唾液酸的FITCSNA标记物反应[1], 即1×106的细胞悬浮在50 μL染色缓冲液（含1 μg FITCSNA/50 μL的PBS缓冲液）中, 4℃孵育1 h。细胞以PBS洗涤后立即进行流式细胞仪检测。另取1×106个未被转染的SW480细胞, 用50 μL PBS缓冲液替代50 μL染色缓冲液, 按上述方法处理后作为阴性对照。以平均荧光强度（fluorescence intensity, FI）表示细胞表面α2,6唾液酸含量。

　　1.2.7  细胞黏附能力的测定  转染72 h后, 收集各组细胞, 分别将各组细胞用PBS洗涤2次, 将细胞悬液100 μL（1×105个细胞）加入CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒中各孔, 继续常规培养1 h后, 按试剂盒操作说明用PBS轻洗去未黏附细胞, 用490 nm 波长测定每孔的光吸收值（A）, 以A490表示细胞对ECM黏附力大小。

　　1.2.8  细胞侵袭能力的测定  转染72 h后, 收集各组细胞, 分别将各组细胞用PBS洗涤2次, 按试剂盒操作说明, 将细胞悬液300 μL（3×105个细胞）加入细胞侵袭分析试剂盒的Boyden小室的上室, 而在下室加入500 μL含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液, 继续常规培养24 h。取出滤膜, 拭去滤膜表面残留细胞, 固定后经试剂盒提供的专用染液染色, 250倍光镜下随机选取5个视野, 计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数, 以穿膜细胞的相对数目表示细胞侵袭力的大小。

　　1.2.9  统计学处理  检测数据以x±s表示, 组间比较采用方差分析。

　　2  结果

　　2.1  ST6Gal I siRNA 转染对ST6Gal I mRNA表达水平的影响  RTPCR产物经琼脂糖凝胶电泳后, 反映ST6Gal I mRNA相对表达水平的灰度值, 空白组、 脂质体组、 非特异性siRNA组分别为1.013±0.110, 0.932±0.091, 0.967±0.147, 而ST6Gal I siRNA组灰度值为0.405±0.064, 明显低于3个对照组（P<0.05, 图1）。

　　2.2  ST6Gal I siRNA转染对SW480细胞表面α2,6唾液酸含量的影响  转染后实验组与对照组细胞用FITC标记的SNA染色, FCM检测结果表明, ST6Gal I siRNA组的平均荧光强度明显比空白对照组、 脂质体对照组及非特异性siRNA组弱, 即实验组细胞表面α2,6唾液酸含量明显降低（图2）。

　　2.3  ST6Gal I siRNA转染对SW480细胞黏附与侵袭ECM的影响  细胞黏附与侵袭实验结果表明, 与空白对照组、 脂质体对照组及非特异性siRNA组相比, ST6Gal I siRNA组细胞对ECM的黏附力（A490）与侵袭力（穿膜细胞数）均明显下降（P<0.05, 表2）。

　　图1  ST6Gal I表达的RTPCR检测　略

　　图2  SW480细胞表面α2、 6唾液酸含量的FCM分析　略

　　表2  各组的黏附力与侵袭力的比较　略

　　3  讨论

　　侵袭性强, 易早期转移是结肠癌的重要特征, 也是目前结肠癌效果不好或失败的主要原因。研究结肠癌细胞侵袭和转移的分子机制, 寻找针对癌细胞特异的靶点, 无疑对结肠癌患者预后的改善有重要的意义。近年来, ST6Gal I与多种肿瘤转移能力的关系, 已日益受到研究关注[1-5]。Lin等[1]应用反义核酸技术, 用针对ST6Gal I的反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞, 发现该反义寡核苷酸可有效调低ST6Gal I mRNA水平并降低细胞表面α2,6唾液酸含量, 同时还可降低乳腺癌细胞对ECM的黏附和侵袭力。但是, ST6Gal I是否介导了结肠癌细胞的转移行为, 是否能作为治疗结肠癌的特异性靶点, 目前尚未见报道。RNA干扰（RNAi）作为近年新兴的高效、 高特异性基因沉默阻断技术, 已成为肿瘤基因治疗研究中极有潜力的应用技术[6]。当前大部分研究都是根据目的基因, 导入化学合成的具有21 bp的siRNA和体外转录来源的siRNA。本研究中将化学合成的ST6Gal I靶向的siRNA转入结肠癌SW480细胞, 有效干扰和降低了细胞中ST6Gal I mRNA表达水平及细胞表面α2,6唾液酸含量, 提示该方法的确有效抑制了SW480细胞的ST6Gal I基因的表达。肿瘤的侵袭和转移是一个多因素、 多步骤、 多阶段的复杂过程。在肿瘤细胞的侵袭和转移中, ECM是一道天然屏障, 肿瘤细胞的转移在于瘤细胞与屏蔽组织的黏附, 并使之降解, 最终瘤细胞穿越屏蔽向远处转移。黏附和侵袭的过程增加了恶性肿瘤生存和转移的能力, 在肿瘤的转移过程中是关键步骤[7]。基底膜作为ECM的重要成分, 通常被认为是限制肿瘤生长的防线。由于Matrigel胶内含有层黏连蛋白、 Ⅳ型胶原、 纤连蛋白、 硫酸肝素糖蛋白、 触角蛋白、 TGF2β及生长因子等人体ECM的大多数成分, 类似动物的基底膜, 因此, 可模拟最真实的体内环境, 体外检测细胞的侵袭性, 间接反映体内肿瘤侵袭的能力[8]。本研究中使用的检测肿瘤细胞对ECM侵袭力的试剂盒, 即含有Matrigel胶。我们通过使用专门检测肿瘤细胞对ECM黏附与侵袭力的试剂盒, 进行了转染siRNA后SW480细胞对ECM黏附与侵袭力的进一步探讨, 结果发现, 与3个对照组相比, ST6Gal I siRNA组细胞对ECM的黏附与侵袭力均降低, 间接说明ST6Gal I的确参与了结肠癌细胞的转移过程。本研究中采用目前较为先进的RNAi技术, 设计并化学合成了靶向ST6Gal I的siRNA, 将其转入结肠癌SW480细胞, 有效干扰和降低了SW480细胞的ST6Gal I mRNA表达水平及细胞表面α2,6唾液酸含量, 从而使SW480细胞黏附和侵袭细胞外基质的能力也降低, 表明靶向ST6Gal I的RNAi不失为一种降低结肠癌细胞黏附和侵袭细胞外基质的有效手段, 有望成为抑制肿瘤转移的基因治疗的一种新途径或新靶点。本研究的结果还为下一阶段的深入研究奠定了良好基础, 因为siRNA高效的细胞递呈是RNAi技术应用的关键, 所以进一步的研究拟构建靶向ST6Gal I 的siRNA的腺病毒表达载体, 以便提高细胞中siRNA的表达量, 延长RNAi的作用时间。

　　:

　　[1] Lin SQ, Kemmner W, Grigull S, et al. Cell surface alpha 2,6sialylation affects adhesion of breast carcinoma cells[J]. Exp Cell Res, 2002, 276(1): 101-110.

　　[2] Cao Y, Merling A, Crocker PR, et al. Differential expression of betagalactoside alpha 2,6sialyltransferase and sialoglycans in normal and cirrhotic liver and hepatocellular carcinoma[J]. Lab Invest, 2002, 82(11): 1515-1524.

　　[3] Wang PH, Lee WL, Lee YR, et al. Enhanced expression of alpha 2,6sialyltransferase ST6Gal I in cervical squamous cell carcinoma[J]. Gynecol Oncol, 2003, 89(3): 395-401.

　　[4] Petretti T, Kemmner W, Schulze B, et al. Altered mRNA expression of glycosyltransferases in human colorectal carcinomas and liver metastases[J]. Gut, 2000, 46(3): 359-366.

　　[5] Gretschel S, Haensch W, Schlag PM, et al. Clinical relevance of sialyltransferases ST6GALI and ST3GALIII in gastric cancer[J]. Oncology, 2003, 65(2): 139-145.

　　[6] Shankar P, Manjunath N, Lieberman J. The prospect of silencing disease using RNA interference[J]. JAMA, 2005, 293(11): 1367-1373.

　　[7] Eble JA, Haier J. Integrins in cancer treatment[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2006, 6(2): 89-105.

　　[8] 李美星, 王树军, 王  颖, 等. 肿瘤抗原基因OVA66对肿瘤细胞生物学特征的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(2): 185-188.