左旋咪唑对急性EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD28和CD4表达的影响
作者：邱伟文, 郑荣远 韩钊, 卢晔芬, 吴赛珍, 章圣辉, 韩义香
【关键词】 左旋咪唑;,实验变态反应性脑脊髓炎;,CD28;,CD4;,表达
[摘 要] 目的: 探讨左旋咪唑(Levamisole, LMS)对实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)大鼠脊髓内单个核细胞上CD28和CD4表达的影响及其意义。方法: 采用流式细胞术检测EAE大鼠脊髓单个核细胞上CD28和CD4的表达水平。结果: LMS同时给药组和预处理的EAE组大鼠脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达水平, 均明显高于非LMS处理的EAE模型组。结论: LMS能促进EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达, 这可能是LMS诱发的炎性脱髓鞘白质脑病发病机制中的一个重要环节。
[关键词]左旋咪唑; 实验变态反应性脑脊髓炎; CD28; CD4; 表达
左旋咪唑(Levamisole, LMS)为四咪唑的左旋体。1969年, LMS作为广谱驱肠虫药开始使用于临床。1971年, Renoux发现LMS具有增强免疫的作用, 其作为免疫增强剂已被推广用于慢性感染、 皮肤疾病、 自身免疫性疾病及肿瘤等疾病的免疫调节辅助。于1982年LMS开始在我国销售后, 临床使用相当广泛, 但发现其有许多严重的不良反应, 尤其是LMS引起脑炎综合征(或迟发性脑病, 急性脱髓鞘白质脑病)已陆续报道了600多例[1]。郑荣远等[2]完成了多项流行病学调查, 论证了咪唑类驱虫药与该类脑病的发生有因果关系, 发现LMS诱发的炎性脱髓鞘白质脑病的发病率为45.8/10万[3], 但其诱发该病的确切机制仍不清楚。实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)为CD4+T细胞介导的对髓鞘抗原的自身免疫性疾病, 是研究炎性脱髓鞘白质脑病的经典动物模型。我们首次观察到LMS能促进Wistar大鼠急性EAE脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达, 提示这可能是其诱发炎性脱髓鞘白质脑病发病机制中的重要环节。
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar大鼠, 雌性, 6～8周龄, 体质量150～180 g, 由河北省实验动物中心提供。豚鼠（雌雄兼有）, 质量250～300 g, 由温州医学院实验动物中心提供。左旋咪唑购于Sigma公司。BCG、 百口咳疫苗购于卫生部上海生物制品研究所。Percoll淋巴细胞分离液购于美国Pharmacia公司。胰蛋白酶溶液购于杭州吉诺生物医药技术有限公司。FITC 标记的小鼠抗大鼠CD8 抗体、 APC标记的小鼠抗大鼠CD4 抗体、 PE标记的小鼠抗大鼠CD28 抗体以及3种相应荧光素标记的小鼠IgG1抗体, 均购自美国Caltag公司。流式细胞仪(FACSCalibur)为BD公司产品。
1.2 方法
1.2.1 抗原的制备 将豚鼠经腹腔注射100 g/L的水合氯醛麻醉后, 经主动脉灌注生理盐水至无血液流出时, 小心取出脊髓, 剥除脊膜, 加预冷的生理盐水制成50 %（W/V）的豚鼠脊髓匀浆（GPSCH）。将GPSCH与等体积的完全弗氏佐剂（CFA）混匀制成稳定的油包水型乳剂备用。
1.2.2 实验分组 将42只Wistar大鼠随机分为4组,对照组6只, 其余3组各12只。第1组(LMS同时给药组): 先经腹腔注射NS（10 mL/kg）, 2次/d, 共7 d, 再经四足垫皮下注射GPSCHCFA乳剂, 0.4 mL/只, 于第0、 24及48 h腹腔注射LMS (10 mg/kg)。第2组(LMS预处理组): 先经腹腔给Wistar大鼠注射LMS（10 mg/kg）, 2次/d, 共7 d, 再经四足垫皮下注射GPSCHCFA乳剂, 共0.4 mL/只, 于第0、 24及48 h腹腔注射同量NS。第3组（EAE模型组）: 先经腹腔注射NS 10 mg/kg, 2次/日, 共7 d, 再经四足垫皮下注射GPSCHCFA乳剂, 共0.4 mL/只, 于第0、 24及48 h经腹腔注射同量的NS。第4组（对照组）: 先经腹腔给Wistar大鼠注射同量的NS, 2次/d, 共7 d, 再经四足垫皮下注射CFA和NS制成的乳剂, 共0.4 mL/只, 于第0、 24及48 h腹腔注射同量的NS。4组动物均在免疫后的当日, 经右腹股沟皮下注射百口咳疫苗0.1 mL（约1×109菌体）。
1.2.3 动物行为改变的观察 免疫后每日早晚各观察动物行为的改变1次, 并详细记录, 同时记录其体质量的变化, 于第25天全部处死。
1.2.4 大鼠神经功能受损情况观察 根据Kono等[4]报道的标准, 定为0～5分: 无明显异常者为0分, 尾巴无力者为1分, 轻微后肢无力者为2分, 严重后肢麻痹者为3分, 四肢麻痹者为4分, 死亡者为5分。
1.2.5 大鼠脑、 脊髓的病理检查 将Wistar大鼠以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后, 用300 mL预冷的GKN液(8 g/L NaCl、 04 g/L KCl、 356 g/L Na2HPO412H2O、 078 g/L NaH2PO42H2O、 2 g/L葡萄糖及2000 U/L肝素, pH74)经主动脉灌流至无血液流出时, 小心取出脊髓及脑组织。取一小段颈髓及部分脑组织依次经40 g/L多聚甲醛固定、 石蜡包埋及常规苏木素伊红染色(切片厚5 μm)和Luxol Fast Blue髓鞘染色(切片厚10 μm)后, 在光学显微镜下进行病检查。
1.2.6 脊髓单个核细胞上CD4、 CD8及CD28表达的检测 按Pope等[5]报道的方法制备脊髓单个核细胞, 并调整细胞数为5×109/L。于100 μL单个核细胞中加入不同荧光素标记的抗CD4、 CD8及CD28抗体各05 μg避光孵育30 min, 用PBS清洗1次, 再加入10 g/L多聚甲醛200 μL待测。同时在含有100 μL单核细胞的另1管中加入3种荧光标志的小鼠IgG1抗体避光孵育作为阴性对照。最后上流式细胞仪检测, 用CellQuest V32软件对获取的结果进行分析, 每份样品分析20000个细胞, 减去阴性对照的结果后, 以CD4+ 、 CD8+、 CD28+细胞数的百分比表示CD4、 CD8及CD28的表达。
1.2.7 统计学处理 各种检测所获数据均以x±s表示, 组间比较采用方差分析（OneWay ANOVA）。大鼠的发病率采用Chi square检验, 所有数据均采用SPSS11.5统计软件进行处理。
2 结果
2.1 Wistar大鼠的发病及神经受损情况 对照组大鼠未出现症状, 体质量持续增长, 活动度正常。第1、 2组（即LMS同时给药组和LMS预处理组）、 第3组（EAE模型组）大鼠于免疫后12 d, 开始陆续发病。发病前2~3 d, 出现进食减少、 体重下降、 毛发失去光泽甚至竖毛, 并出现尾巴无力、 瘫痪, 继而后肢无力及瘫痪; 多伴有大小便失禁, 部分累及前肢。第1、 2组大鼠的病情进展快, 神经功能损害重, 平均最大评分明显高于第3组; 但发病率和发病的潜伏期无统计学意义。各组大鼠的发病及神经受损情况见表1。
表1 Wistar大鼠EAE的发病情况及症状评分 略
2.2 病改变 对照组大鼠脑及脊髓的病理检查, 未发现炎性细胞浸润及脱髓鞘改变。EAE模型组大鼠的脑及脊髓实质内, 小血管周围有较多的炎性细胞浸润, 以淋巴细胞为主, 典型者呈血管袖套样改变, 髓鞘染色发现局灶性脱髓鞘。LMS同时给药组和LMS预处理组中炎性细胞的浸润及脱髓鞘改变更明显, 可见到较多的血管袖套样改变, 神经细胞肿胀、 变性、 坏死, 并可见胶质细胞增生、 小结节形成等。
2.3 EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD4、 CD8及CD28的表达 EAE模型组Wistar大鼠脊髓内单个核细胞上CD4的表达最高, CD28的表达也较高, 而CD8的表达水平最低。LMS同时给药组和LMS预处理组大鼠脊髓内单个核细胞上CD4、 CD28的表达水平较EAE模型组明显增高, 有显著统计学差异; 而CD8的表达无明显变化（表2）。
表2 EAE大鼠脊髓单个核细胞上CD4、 CD8及CD28的表达 略
3 讨论
LMS诱发的炎性脱髓鞘白质脑病的确切机制仍不清楚。大多数学者推测, 可能为LMS产生的直接免疫反应或LMS对免疫系统的增强作用, 即体内针对自身髓鞘抗原的T细胞被激活而引起自身免疫。LMS加重与促发EAE的作用, 已被较多的实验所证明。邢清和等[6]研究发现, LMS可提高EAE的发病率, 加重其临床症状, 并能促进EAE复发, 明显促进EAE大鼠脊髓内IL1α、 IL1β、 IL2 、 ICAM1及IFNγ mRNA的表达。李勇等[7]研究发现, LMS加CFA可直接激发Wistar大鼠产生EAE。EAE是CD4+ T细胞介导的自身免疫性疾病。T细胞的活化需要两个刺激信号: 第1信号为T细胞表面的TCR/CD3复合物与抗原提呈细胞上MHCⅡ类抗原及抗原肽相结合; 第2信号又称协同刺激信号, 为T细胞上的协同刺激分子与APC表面的配体相结合所提供。虽然还有41BB等其它协同刺激分子参与T细胞的活化和增殖, 但CD28是诱导T细胞的活化的重要协同刺激分子, 而且可能优先诱导CD4+ T细胞活化[8]。CD28/B7协同刺激途径激活可明显促进IL2合成, 上调抗调亡分子BclxL, 促进T细胞活化, 促进EAE的发病。CD28-/-或CD28肽类似物可干扰其与配体结合明显抑制EAE的发病[9]。我们发现, 急性EAE大鼠病理改变主要为脑、 脊髓实质内小血管周围炎性细胞的浸润, 典型者呈血管袖套样改变, 髓鞘染色可发现局灶性脱髓鞘。脊髓提取的单个核细胞（主要为淋巴细胞）中以CD4+细胞为主, 支持EAE主要为CD4+ T细胞介导的以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。在给予GPSCHCFA致敏的基础上, 同时给予10 mg/kg的LMS后可明显加重EAE大鼠的症状, 平均最大评分明显增高(P<0.01), 与邢清和等[6]报道的结果相一致。本研究首次发现, 给予LMS预处理也能加重EAE大鼠的症状和病理改变。LMS同时给药及LMS预处理组均可明显促进Wistar大鼠EAE急性期脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达, 而对CD8的表达无明显影响, 故CD4+/CD8+细胞的比值升高。与EAE模型组相比较, LMS同时给药组及LMS预处理组大鼠中CD28+和CD4+细胞数增加近1倍, 与其神经受损的情况及病理改变相一致。LMS作为一种免疫刺激剂,能诱导T细胞活化, 增加CD4的表达, 提高细胞免疫水平[10]。CD28表达的增加, 通过CD28/B71或B72协同刺激途径, 可促进更多T细胞活化增殖, 减少其调亡, 并促进其分泌更多的促炎细胞因子（如IL2）等, 进一步加重EAE的炎症过程。以上表明, LMS能上调急性期EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达, 提示其在中枢神经系统自身免疫性疾病中具有增强免疫病理的作用, 可能是其诱发炎性脱髓鞘白质脑病发病机制中的重要环节。
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