脂多糖诱发的同基因妊娠BALB/c和NOD/SCID小鼠早产模型

             作者：林羿, 刘兆宇, 狄静芳, 曾耀英

【关键词】  免疫缺陷;,妊娠耐受;,早产;,啮齿动物模型

　　Premature delivery induced by LPS in syngenetically impregnated BALB/c and NOD/SCID mice

　　　[Abstract]  AIM: To extend understanding of the mechanism of lipopolysaccharide (LPS)induced preterm delivery in syngenetically impregnated BALB/c and NOD/SCID (nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency) mice. METHODS: Strategies of LPS stimulation were pursued with or without previous Tolllike receptor 4 (TLR4) blocking. The incidence of LPSinduced preterm delivery and fetal death were compared between the BALB/c and NOD/SCID groups. Guided by the time when all expected preterm deliveries have occurred in the first experiment (i.e., day 16 of gestation), the LPSstimulated mice, with or without previous TLR4 blocking, were killed at the beginning of preterm labor and pooled placentas were collected in each mouse in the second experiment. The expression of cell surface TLR4, CD80, and intracellular TNFα in placenta CD45+ cell population was determined by flow cytometry(FCM). RESULTS: It displayed that preterm delivery could be induced by LPS in BALB/c mice, while the NOD/SCID mice seemed to be resistant to LPS induction. Upon LPS stimulation, TLR4 expression was not changed either in BALB/c or in NOD/SCID mice, but the CD45+CD80+ cell percentage was elevated in both groups. However, the CD45+TNFα+ cell percentage was increased merely in BALB/c mice after stimulation, while no such trend was observed in NOD/SCID mice. In BALB/c mice, the effect of LPS on CD80 and TNFα expression could be abrogated by previous TLR4 blocking, which subsequently prevented LPSinduced preterm delivery. CONCLUSION: Although LPS do not alter TLR4 expression, it interacts with this receptor, triggers the mobilization of CD45+CD80+ cells, results in elevated production of inflammatory cytokines, and finally results in preterm delivery. The diversity of sensitivity to LPS induction observed in BALB/c and NOD/SCID mice implies that the lack of functional T and NK cells in the NOD/SCID may be the reason why the NOD/SCID appeared to be resistant to LPSinduced premature labor.

　　[Keywords]immunodeficiency; pregnancy tolerance; premature labor; rodent model

　　[摘 要]  目的: 研究脂多糖(LPS)诱发同基因妊娠BALB/c小鼠和非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠早产的机制。方法: 在预先阻断或未阻断Toll样受体4(TLR4)的条件下采用LPS刺激, 并比较各组BALB/c和NOD/SCID小鼠的早产率和胚胎死亡率。由于预实验显示预期的早产均发生于孕16 d, 因此, 实验中在早产发生之前处死小鼠, 收集每只孕鼠的胎盘。采用流式细胞术检测胎盘CD45+细胞表面TLR4、 CD80和细胞内TNFα的表达率。结果: 采用LPS可诱发BALB/c小鼠早产, 而NOD/SCID小鼠则对LPS的诱导有抵抗。经LPS刺激后, TLR4的表达在BALB/c和NOD/SCID小鼠均无显著改变, 但是两组小鼠CD45+CD80+细胞的百分率均升高。相反, LPS刺激后仅BALB/c小鼠CD45+TNFα+细胞的百分率升高, 而NOD/SCID小鼠则否。通过预先阻断TLR4的表达可消除LPS对BALB/c小鼠CD80和TNFα 表达的影响, 并显著降低LPS诱发的早产率。结论: 虽然LPS未能改变TLR4的表达, 但是二者相互作用, 可激发CD45+CD80+细胞的动员, 导致炎性细胞因子产生增多, 并最终导致早产。BALB/c和NOD/SCID小鼠对LPS刺激的敏感性存在差异,  提示NOD/SCID小鼠缺乏功能正常的T细胞和NK细胞, 可能是这种小鼠对LPS诱发的早产有抵抗的原因之一。

　　[关键词]免疫缺陷; 妊娠耐受; 早产; 啮齿动物模型
   
　　Toll样受体(Tolllike receptor, TLR)是具有天然识别功能的受体家族, 其特征性结构是氨基末端富含亮氨酸重复序列的结构域和羧基末端有IL1R信号传递结构域。TLR家族成员通过识别微生物的特征性分子而启动固有免疫或修饰适应性免疫。例如TLR3(CD283)[1]可识别病毒的特征性产物双链RNA, TLR4(CD284)[1]可识别细菌的特征性产物脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等[2]。有关病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular pattern, PAMP)以及识别PAMP的模式识别受体概念的提出, 标志着固有免疫研究进入了崭新的阶段[1]。目前认为, 细菌或其代谢产物诱发早产的分子基础是一系列的级联信号传导过程, 细胞表面TLR对致病原的识别可触发这一过程,随后通过多条渠道引起子宫颈成熟、 临产, 并最终导致早产。这一领域的重要研究目的之一是阐明上述过程的复杂机制, 从而制定合理的早产预防和方案, 尽可能减少毒副作用并保证疗效, 为此, 必须建立有效的动物模型。由于炎性因子诱发小鼠早产的分子机制与人类十分相似, 所以建立小鼠模型是研究早产发病机制的重要辅助工具。本研究比较了LPS诱导后, 同基因妊娠BALB/c和NOD/SCID小鼠(NOD/SCID×NOD/SCID和BALB/c×BALB/c)的早产发生率, 并研究了在预先阻断或不阻断TLR4的情况下, LPS诱发这些小鼠早产的可能机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  10～12周龄BALB/c和NOD/SCID小鼠购于中山大学实验动物中心, 在特殊无致病原条件下饲养, 建立同基因交配组合BALB/c×BALB/c和NOD/SCID×NOD/SCID。出现阴道栓或阴道内发现精子定义为孕0 d。LPS（血清型055∶B5）购于SigmaAldrich公司透膜缓冲液、 大鼠抗小鼠TLR4抗体（克隆号MTS510）、 抗TLR4单克隆抗体(mAb)PE、 抗CD45 mAbFITC、 抗CD80 mAbPE、 抗TNFα mAbPE及FITC和PE标记的同型对照抗体, 分别购于EBiosciences或BD Pharmingen公司。FACS Calibur流式细胞仪购于Becton Dickinson公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  诱发性早产小鼠模型的建立  将BALB/c和NOD/SCID孕鼠均分为实验组和对照组, 每组12只。实验组: 孕15 d时, 给BALB/c和NOD/SCID孕鼠腹腔注射LPS盐溶液, 剂量为50 μg/kg体质量, 间隔3 h, 共注射2次(2∶00和5∶00 PM)。对照组在相同时点注射等体积的PBS。观察早产的发生率(即早于孕19 d分娩)。至孕20 d仍未分娩的小鼠处死, 死胎率[3]。

　　1.2.2  TLR4预先阻断的作用  采用多次注射纯化的大鼠抗小鼠TLR4抗体（克隆号MTS510）的方法阻断这种受体。即原装抗体按1∶10用无菌PBS稀释后, 分别在孕7、 10和13 d各注射200 μL。此后按1.2.1中的方法注射LPS盐溶液, 与未预先阻断TLR4的LPS刺激组比较早产率和死胎率。

　　1.2.3  单个核细胞悬液的制备  在孕16 d早8时许, 处死经或未经LPS刺激的孕鼠（因观察到预期的早产均发生于孕16 d午后或夜间）, 收集每只孕鼠的胎盘, 并采用[4]介绍的方法制备单个细胞悬液。简言之, 收集去除了胚胎但含有底蜕膜组织的小鼠胎盘, 用虹膜剪剪碎至约1 mm3的大小, 经50 μm孔径的尼龙网过滤后, 即为单个细胞悬液。用淋巴细胞分离液以梯度离心法纯化淋巴细胞, 并加红细胞裂解液孵育以去除混入的红细胞。

　　1.2.4  TLR4、 CD80和TNFα表达的流式细胞术检测  (1) CD45+细胞表面TLR4和CD80表达的检测: 将单个核细胞（106/mL）分别与下述荧光抗体: 抗CD45 mAbFITC和抗TLR4 mAbPE; 抗CD45 mAbFITC和抗CD80 mAbPE; 抗CD45 mAbFITC和抗TNFα mAbPE混合, 总体积为50 μL, 室温下孵育30 min。以PBS洗涤2次, 将细胞重新悬浮于10 g/L多聚甲醛中, 于24 h内采用FACS Calibur流式细胞仪检测, 并以专用软件分析。采用FITC和PE标记的同型对照抗体, 设置适当的阈捕获淋巴样细胞,   每份样品检测104个细胞[4]。(2) CD45+细胞内TNFα表达的检测: 首先用抗CD45 mAbFITC染色, 以PBS洗涤, 再将细胞重悬于含有1 g/L皂素和0.99 g/L叠氮钠的透膜液内, 在4℃孵育1 h离心弃上清,  加入抗TNFα mAbPE（0.25 μg/106细胞）, 总体积50 μL。室温避光孵育20 min, 以PBS洗涤后,   用流式细胞术进行检测[5]。

　　1.2.5  统计学分析  采用χ2 检验分析LPS刺激组和相应对照组、 BALB/c组和相应NOD/SCID组的早产率和死胎率。采用t检验比较CD45+细胞群中TLR4+细胞和CD80+细胞的百分率。

　　2  结果

　　2.1  BALB/c和NOD/SCID小鼠早产率的比较  在预先阻断或不阻断TLR4的情况下, 检测经LPS刺激的BALB/c和NOD/SCID小鼠的早产率。以注射PBS作为对照的BALB/c和NOD/SCID小鼠均未发生早产; 未预先阻断TLR4的BALB/c小鼠经LPS刺激后, 早产率为50%(6/12), 显著高于PBS对照组(P<0.01)。预先用中和抗体阻断TLR4, 可显著减弱LPS诱导BALB/c小鼠发生早产的作用, 其早产率仅为8.3% (1/12), 显著低于未预先阻断TLR4的LPS刺激组(P<0.05); 但与注射PBS的对照组相比较无统计学意义。此外, 观察到在LPS刺激后的早产均发生于孕16 d的下午或夜间。LPS诱导后NOD/SCID小鼠的早产率仅为8.3%(1/12), 显著低于相同方法诱导后的BALB/c小鼠(P<0.01), 与注射PBS的NOD/SCID小鼠的早产率无统计学意义; 早产也均发生于孕16 d。预先阻断TLR4后, 经LPS刺激的NOD/SCID小鼠未发生早产(0/12)。

　　2.2  BALB/c与NOD/SCID小鼠死胎率的比较  分别检测了BALB/c和NOD/SCID小鼠经或未经LPS刺激后, 孕16 d和20 d孕鼠的死胎率 (表1)。在BALB/c小鼠, PBS对照组孕16 d孕鼠的死胎率为3.0%, 与LPS刺激组无显著性差异(6.6%, P>0.05)。相反, LPS刺激组孕20 d孕鼠的死胎率显著高于PBS组(分别为17.3%和4.9%, P<0.05)。在预先阻断TLR4组, LPS刺激后BALB/c孕鼠的死胎率下降至7.5%, 但两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。在NOD/SCID小鼠, LPS刺激后孕16 d或20 d孕鼠的死胎率均无显著增高。预先阻断TLR4, 既未降低也未增高孕期在上述时点的死胎率(表1)。

　　表1  不同孕期 BALB/c和NOD/SCID小鼠的死胎率　略

　　2.3  TLR4表达的模式  采用流式细胞术在BALB/c和NOD/SCID小鼠胎盘中CD45+细胞的表面, 均可检出基线水平的TLR4表达(阳性细胞率分别约为2.4%和1.9%), 但两种小鼠TLR4的基线表达率无显著差异。此外, 采用流式细胞术在从胎盘组织分离的单细胞悬液中, 几乎未能检出CD45-TLR4+细胞。LPS刺激后, BALB/c和NOD/SCID孕鼠CD45+细胞群中TLR4+细胞的百分率无显著改变, 预先注射抗TLR4抗体后再施加LPS刺激也无改变(图1A1-6)。

　　2.4  CD45+CD80+细胞亚群的变化  在LPS刺激下, BALB/c孕鼠中CD45+CD80+细胞的百分率与PBS组相比较显著增高, 分别为(17.2±1.7)%和(5.7±0.5)%(P<0.01)。预先阻断TLR4几乎可完全逆转这种作用。在NOD/SCID小鼠中也可观察到相似的结果。LPS刺激可使CD45+CD80+细胞的百分率上升至大约11.0%。相反, 在预先阻断TLR4的NOD/SCID小鼠中, CD45+CD80+细胞的百分率仍保持在与PBS组相似的水平(表1、 图1B18)。

　　2.5  胎盘中CD45+细胞内TNFα的表达  在BALB/c与NOD/SCID小鼠的PBS组中, CD45+TNFα+细胞的百分率均较低。但经LPS刺激后, BALB/c小鼠胎盘中CD45+细胞内TNFα的表达增强; 而在NOD/SCID小鼠则未观察到这种趋势。在BALB/c小鼠, 预先阻断TLR4几乎可完全逆转LPS对TNFα表达的诱导作用; 而在NOD/SCID小鼠中未观察到这种现象。无论是否预先阻断TLR4, LPS刺激后CD45+TNFα+/ CD45+细胞的百分率均保持不变（图1C 1-8）。

　　图1  CD45+细胞上TLR4、 CD80及细胞内TNFα表达的流式细胞术检测　略
 
　　3  讨论

　　TLR家族成员可直接识别并与细菌和病毒的特异性分子反应, 进行细胞信号传导, 导致细胞因子和趋化因子等发生一系列变化, 促进宫颈成熟、 静息状态的子宫转为节律性收缩状态, 最终发生早产。以往研究证实, TLR4是LPS或灭活的大肠杆菌诱发早产的必要因素, TNF等基因表达的增强与LPS诱发早产的发病机制有关[6]。在本研究中, 采用流式细胞术在BALB/c和NOD/SCID小鼠胎盘中, 均可检出少量CD45+TLR4+细胞。在LPS刺激后, BALB/c和NOD/SCID小鼠胎盘中CD45+TLR4+细胞的百分率均无显著改变; 但CD45+CD80+细胞的百分率均显著增高。这一结果提示, LPS作为刺激剂对TLR4的表达可能并无显著影响, 但LPS能与TLR4相互作用, 激活下游的信号传导介质, 导致炎性细胞因子的产生增多, 并随后导致早产。通过TLR信号传导机制能诱导DC的成熟。这一过程的特征包括CD80等共刺激分子的表达增强, 细胞因子的分泌增多等[7]。在本研究中, 虽然BALB/c和NOD/SCID小鼠胎盘中CD45+细胞表面CD80的表达均增强, 但细胞内TNFα的表达仅在BALB/c小鼠有显著增多, 而在NOD/SCID小鼠则无显著改变。与此相应, LPS刺激后仅BALB/c小鼠的早产率有显著增高, 而NOD/SCID小鼠则否。这些结果提示, NOD/SCID小鼠缺乏功能正常的T细胞和NK细胞, 可能是其对LPS诱发的早产有抵抗的原因之一。为进一步证实这种判断, 本研究采用在LPS刺激前预先多次注射中和抗体的方法阻断TLR4。结果显示, 阻断TLR4既能逆转LPS刺激所引起的CD45+CD80+细胞表达率的增加, 也能逆转CD45+TNFα+细胞百分率的增高, 并最终降低BALB/c小鼠的早产率。与此相似, 预先阻断TLR4也能消除LPS刺激引起的NOD/SCID小鼠CD45+CD80+细胞百分率的增高, 但在下游事件中, 无论是否预先阻断TLR4, 在LPS刺激下NOD/SCID小鼠胎盘中CD45+细胞上TNFα的表达均呈低水平, 并且相互间无显著差异; 相应地, NOD/SCID小鼠的早产率也均较低。这些结果提示, BALB/c小鼠的早产是由LPS与其特异性受体TLR4相互作用而触发的。触发后出现CD45+CD80+细胞的活化或动员, 作为抗原提呈细胞, 可导致某些T细胞或NK细胞亚群的激活, 并由此使TNFα等炎性细胞因子的合成和分泌增多, 最终启动分娩程序导致早产。目前认为, 早产并非一个简单事件, 而是一系列激活事件最终的共同结果。其中诱发因素包括子宫的过度伸展, 子宫内或子宫外感染, 子宫内出血和子宫结构异常, 内分泌失调及子宫颈因素等。导致早产的信号级联传递过程, 受某些因素的调节, 其中抑制性因素包括前列腺素合成的抑制剂、 抗炎症因子（如IL10或IL1受体拮抗剂）等。针对这些因素的研究成果是临床预防和早产的理论和实验依据。相反, TNFα既能诱发早产, 又能激活触发分娩的信号传递过程的中间步骤[8]。已经证实, 当暴露于细菌时, 子宫产生的TNFα等炎性细胞因子增多。TLR4既可通过骨髓分化原始反应蛋白88(myeloid differentiation primaryresponse protein 88, MyD88)依赖性途径, 又可通过非依赖性途径, 诱导产生包括TNFα在内的炎性细胞因子[9]。本研究在BALB/c和NOD/SCID小鼠模型中的观察结果支持上述观点: 在BALB/c小鼠, TNFα的增多与早产率的增高相伴随; 相反, LPS刺激后, NOD/SCID小鼠无TNFα的增多, 相应地这些小鼠的早产率也较低。

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