正常人周围血初始和记忆T细胞亚群及细胞因子表达的探讨

【关键词】  初始和记忆T细胞;,T细胞亚群;,细胞表面标志;,细胞因子

　　Subpopulations and cytokine expression of nave and memory T cells in normal human PBMCs

　　[Abstract]  AIM: To determine subpopulations and cytokine expression of nave and memory T cells by polychromatic flow cytometry (PFC). METHODS: PBMCs were separated from normal human peripheral blood and stimulated by superantigen (SEB). After incubation for 5 hours, the cells were fixed, permeablized and stained with multiplecolorlabeled mAbs for cell surface and intracellular cytokines. Then they were detected by polychromatic flow cytometry and the data were analyzed by Flow Jo software. RESULTS: Based on the expression of CD45RO molecules, CD4+ and CD8+ T cells were classified as nave and memory cells, which were further devided into several subsets according to the expression of CD62L and CCR7. When PBMCs were stimulated by SEB for 5 hours, CD45RO+ and CD45RO-CD4+ or CD8+ T cells expressed IL2, IFNγ and TNFα. Further analysis indicated that CD62LloCCR7lo and CCR7+ T cells but not CD62Lhi and CD62LhiCCR7+ T cells expressed cytokines. In addition, the percentage of cytokine expression in CD62Llo CCR7lo subsets was markedly higher than that in CCR7+ subsets. CONCLUSION: It is not scientific to identify nave and memory cells in human T cells only based on the expression of CD45RO. Accurate determination of nave, effector and memory cell populations can be achieved not only based on the expression of CD45RO but also according to the expression of CD62L.

　　[Keywords]nave ＆ memory T cells; T cell subset; cell surface marker; cytokine

　　[摘 要]  目的: 利用多色流式检测技术探讨初始和记忆T细胞亚群与细胞因子表达之间的关系。方法: 自正常人静脉血中分离PBMC, 经超抗原（SEB）刺激5 h后, 加入多种抗细胞表面标记和抗细胞因子抗体进行染色, 利用流式细胞术检测, 并利用Flow Jo软件分析结果。结果: 根据CD45RO表达与否, 将CD4+和CD8+ T细胞分为初始和记忆T细胞,     再根据归巢受体（CD62L）和趋化因子受体（CCR7）的表达与否, 将初始和记忆T细胞进一步分为不同的亚群。当T细胞受到SEB激活后, CD45RO+和CD45RO-的CD4+或CD8+ T细胞均表达IL2、 IFNγ和TNFα。进一步分析结果表明, CD62Lhi和CD62LhiCCR7+细胞不表达细胞因子, 而CD62LloCCR7lo和CCR7+ T细胞均表达细胞因子, 其中CD62LloCCR7lo细胞表达细胞因子的阳性率明显高于CCR7+细胞亚群。结论: 只利用CD45RO表达与否区分初始和记忆T细胞是不够准确的, 同时检测CD62L的表达, 可明显地提高其准确性。

　　[关键词]初始和记忆T细胞; T细胞亚群; 细胞表面标志; 细胞因子
   
　　人周围血T细胞主要是由CD4+和CD8+ T细胞所组成, 根据其表型、 功能和不同的组织分布, 将T细胞分为许多亚群[1-3]。传统的鉴别初始和记忆T细胞的方法, 是根据CD45RO或CD45RA的表达与否: CD45RO-或CD45RA+者为初始T细胞, 反之为记忆T细胞。在记忆T细胞中, 根据归巢受体CD62L和趋化因子受体CCR7的表达与否, 又可将记忆T细胞分为中央型（TCM）和效应型（TEM）细胞[4-7]。目前, 利用多色流式细胞仪检测技术（polychromatic flow cytometry, PFC）结合多种抗体标记同时染色法, 可将周围血T细胞进一步分为几十甚至上百个亚群[2, 3]。对这些微小细胞亚群的探讨, 将进一步揭示免疫功能在生理和病理的情况下的变化。本研究中利用PFC技术同时结合多种抗体进行细胞表面标记和细胞内细胞因子的检测, 探讨了细胞亚群和细胞因子产生之间的关系, 该研究将为基础和临床研究奠定基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  Cy7PE标记的抗CD3单克隆抗体（mAb）、 Q605标记的抗CD4 mAb、 Cy5.5APC标记的抗CD8 mAb、 Cy7APC标记的抗CD45RO mAb、 Cas B标记的抗CCR7 mAb、 Q705标记的抗CD62L mAb、 PE标记的抗IL2 mAb、 APC标记的抗IFNγ mAb和FITC标记的抗TNFα mAb, 购自BD/Pharmingen公司或由美国国立卫生研究院惠赠。SEB及皂素（saponin）购自Sigma公司。RPMI1640培养液和Hank’s缓冲液购自GIBCO公司。流式细胞检测仪为BD公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  人外周血单个核细胞（PBMC）的分离  抽取健康志愿者静脉血, 肝素抗凝, 以Hank’s缓冲液等体积稀释后, 用Ficoll进行密度梯度离心（于22℃ 2000 r/min离心20 min）获取PBMC。充分洗涤后, 用RPMI1640 完全培养液调整PBMC的密度为2×109/L。

　　1.2.2  细胞染色  细胞染色按照常规染色方法进行操作。（1）细胞表面分子的检测: 简言之, 取细胞悬液100 μL, 加入标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体, 于4℃避光反应30 min, 洗涤2次（1 800 r/min离心8 min）。（2）细胞内细胞因子的染色: 将待测细胞用PBS洗涤2次后, 加入细胞固定液室温固定7 min, 洗涤2次。然后加入200 μL含有通透剂（saponin）的缓冲液作用2 h, 再加入特异性的胞内标记的mAb, 于4℃避光反应30 min, 洗涤2次。以300 μL染色缓冲液重悬细胞, 应用流式细胞术检测细胞, 并用Flow Jo软件分析流式细胞术检测结果。

　　2  结果

　　2.1   初始和记忆T细胞亚群的表型特征  正常人PBMC中CD3+ T细胞(图1A)是由CD4+(图1B)和CD8+(图1C)T细胞所组成。根据CD45RO的表达与否, 可将CD4+ T细胞分为CD4+CD45RO+和CD4+CD45RO-两个细胞亚群(图1B); 同样可将CD8+ T细胞分为CD8+CD45RO+和CD8+CD45RO-细胞亚群(图1C)。这些细胞亚群代表着初始T细胞（CD45RO-）和记忆T细胞（CD45RO+）。再根据归巢受体（CD62L）和趋化因子受体（CCR7）的表达与否, 可将初始CD4+ T细胞(图1E)、 记忆CD4+ T细胞(图1D)、 初始CD8+ T细胞(图1G)和记忆CD8+ T细胞(图1F)进一步分为4个不同的细胞亚群。从图1D、 E、 F和G中可以看出, 初始和记忆T细胞CD62L和CCR7的表达存在着明显的差异。

　　2.2  初始和记忆T细胞细胞因子的表达  为了进一步探讨初始和记忆T细胞的表型和功能之间的关系, 利用超抗原(SEB)短暂（5 h）刺激PBMC后, 观察初始(图2A、 C)和记忆(图2A、 B)CD4+ T细胞中IL2、 IFNγ和TNFα的表达以及相互之间的关系。结果表明, 记忆CD4+ T细胞(图2B)中IL2、 IFNγ和TNFα的表达明显高于初始CD4+ T细胞(图2C)。同样地, 当初始(图3A、 C)和记忆(图3A、 B)CD8+ T细胞经SEB刺激后, 其细胞因子表达的结果与CD4+ T细胞表达的结果相似。此外, 不论是初始还是记忆T细胞, 在SEB刺激后, 其中的部分细胞同时产生一种或多种细胞因子。

　　图1 －图3  略

　　2.3  初始和记忆CD4+ T细胞亚群中细胞因子的表达  初始CD4+ T细胞, 根据CD62L和CCR7的表达与否, 可以分为4个亚群(图4A), 即CD62L+、 CD62L+CCR7+、 CD62L-CCR7-、 CCR7+细胞。深入分析这4个细胞亚群细胞因子产生的结果表明, CD62L+(图4B)和CD62L+CCR7+(图4C)亚群基本不表达IL2和IFNγ, CD62L-  CCR7-亚群(图4D)中有7.61%的细胞只表达IL2, 5.41%的细胞同时表达IL2和IFNγ, 6.02%的细胞只表达IFNγ; 而在CCR7+亚群(图4E)中, 6.93%的细胞只表达IL2, 同时表达IL2和IFNγ或只表达IFNγ的细胞的百分率较低, 分别为0.21%和1.06%。同样地, 从分析CD4+CD45RO+细胞亚群(图5A)的细胞因子表达的结果中, 获得与上述相类似的结果。CD62L+(图5B)和CD62L+CCR7+(图5C)细胞亚群基本不表达细胞因子, 而CD62L-CCR7-亚群(图5D)中, 只表达IL2的细胞为11.60%, 同时表达IL2和IFNγ的细胞为7.06%, 只表达IFNγ的细胞为4.15%; 在CD62L-CCR7+亚群(图5E)中, 只表达IL2的细胞为13.20%, 同时表达IL2和IFNγ的细胞为2.41%, 只表达IFNγ的细胞为3.58%。

　　图4  略
 
　　2.4  初始和记忆CD8+ T细胞亚群细胞因子的表达  初始CD8+ T细胞, 根据CD62L和CCR7的表达与否, 可以分为4个亚群(图6A), 即CD62L+、 CD62L+/CCR7+、 CD62L-CCR7-、 CCR7+细胞。进一步分析这4种细胞亚群细胞因子的表达, 结果表明, CD62L+(图6B)和CD62L+CCR7+(图6C)亚群基本不表达IL2和IFNγ。在CD62L-CCR7-亚群(图6D)中, 有极少数细胞（0.48%）只表达IL2, 5.82%的细胞同时表达IL2和IFNγ, 16.30%的细胞只表达IFNγ。 在CCR7+亚群(图6E)中, 1.01％的细胞只表达IL2, 0.58%的细胞同时表达IL2和IFNγ, 3.61%的细胞只表达IFNγ。 同样地, 从分析CD8+CD45RO+细胞亚群(图7A)细胞因子表达的结果中, 也获得与上述相类似的结果。CD62L+(图7B)和CD62L+CCR7+(图7C)细胞亚群基本不表达IL2和IFNγ, 在 CD62L-CCR7-亚群(图7D)中, 1.87％的细胞只表达IL2, 6.66%的细胞同时表达IL2和IFNγ, 13.17％的细胞只表达IFNγ。在CCR7+亚群(图7E)中, 2.30%的细胞只表达IL2, 1.42%的细胞同时表达IL2和IFNγ, 7.08%的细胞只表达IFNγ。

　　图5 －图7  略

　　3  讨论

　　我们利用多种染色流式细胞术同时结合多种标记抗体染色技术, 对正常人CD4+和CD8+ T细胞亚群进行了分析。其结果与[6]和我们以前报道[1]的结果相一致。CD4+和CD8+ T细胞可分为CD45RO+ 和CD45RO-亚群, 而这些亚群又可进一步分为CD62L+、 CD62L+CCR7+、 CD62L-CCR7-以及CCR7+细胞亚群, 证明正常人外周血T细胞表型的多样性[1, 6, 7]。目前, 根据细胞表面标记的不同, 可以将T细胞分为几十或上百个细胞亚群[2, 3]。传统上, 只利用CD45RO或CD45RA的表达与否来鉴别初始和记忆T细胞。事实上, 初始和记忆T细胞除了表型不同外, 其细胞因子的产生和功能亦存在着不同[3, 8]。为此, 我们在以前研究的基础上, 本研究又利用超抗原（SEB）刺激PBMC, 探讨了细胞表型与细胞因子产生之间的关系。结果表明, 只利用单一的细胞表面标记CD45RO的表达与否, 不能完全区分正常人PBMC中的初始和记忆T细胞。从试验结果中可以看出, 当PBMC经SEB刺激后, CD45RO+和CD45RO-的CD4+或CD8+ T细胞均表达IL2、 IFNγ和TNFα, 这些结果与文献[3]报道的结果相一致。众所周知, SEB可激活PBMC中5%～20%的T细胞, 将其与PBMC孵育4～5 h后, 可诱导效应/记忆T细胞而不能诱导初始T细胞表达细胞因子, 说明SEB是一种十分有效的多克隆T细胞激活剂。细胞因子IFNγ和TNFα被认为是效应因子, 直接发挥着免疫效应的功能; 而IL2被认为是细胞存活因子, 参与维持记忆T细胞的存活。在单个细胞水平分析的结果表明, 这3种细胞因子可由同一个细胞或不同细胞产生, 说明了T细胞亚群功能的多样性。结合表型和细胞因子分析的结果表明, 正常人PBMC中T细胞不论在表面标记还是细胞因子的表达上均存在着多样性。从本研究的结果可以看出, 只根据CD45RO的表达与否不能准确地区分初始和记忆T细胞, 但与CD45RO-细胞相比, CD45RO+的CD4+和CD8+ T细胞中表达IL2、 IFNγ和TNFα细胞的百分率都明显增加。此外, 不论CD45RO的表达与否, CD62L-CCR7-以及CCR7+细胞均高表达IL2和/或IFNγ, 表明效应型和中央型记忆T细胞之间的差异[3, 6]。综上所述, 正常人PBMC中的T细胞是由表型和功能不同的细胞群体组成。了解不同的细胞亚群, 特别是抗原特异性T细胞亚群的数量和功能, 对于疾病的诊断、 疾病预后的判断以及疫苗的设计和效果的评价, 均具有重要的指导意义。

　　文献:

　　[1] 吴长有, 刘  杰. 利用多种表面标志鉴别正常人周围血初始和记忆T细胞亚群[J]. 免疫学杂志, 2006, 22（2）: 120-123.

　　[2] Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Roederer M. Seventeencolour flow cytometry: unravelling the immune system[J]. Nat Rev Immunol, 2004, 4(8): 648-655.

　　[3] De Rosa SC, Herzenberg LA, Herzenberg LA, et al. 11color, 13parameter flow cytometry: identification of human nave T cells by phenotype, function, and Tcell receptor diversity[J]. Nat Med, 2001, 7(2): 245-248.

　　[4] 吴长有. 初始和记忆T细胞的研究进展[J]. 免疫学, 2005, 25（5）: 353-356.

　　[5] 吴长有. 免疫记忆与疫苗研究开发[J]. 免疫学杂志, 2005, 21（1）: 4-7.

　　[6] Sallusto F, Lenig D, Forster R, et al. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions[J]. Nature, 1999, 401(6754): 708-712.

　　[7] Seder RA, Ahmed R. Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and memory T cell generation[J]. Nat Immunol Rev, 2003, 4（9）: 835-842.

　　[8] 吴长有. 记忆CD8+ T细胞亚群在感染和肿瘤免疫应答中的作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22（3）: 273-275.