抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体重链可变区基因的克隆及序列分析
作者：秦红, 黄威权，杨向民, 温伟红, 杨安钢、
【关键词】 迟缓爱德华菌;,抗独特型抗体;,基因克隆;,序列分析
[摘 要] 目的: 克隆并分析迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体（mAb） VH基因。方法: 从分泌迟缓爱德华菌抗独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）中提取总RNA, 利用RTPCR技术,扩增迟缓爱德华菌抗独特型抗体VH基因, 并将其克隆到PBSTvector中进行序列分析。结果: VH基因的全长序列为339 bp, 编码113个氨基酸。通过NCBI/BLAST/N和IMGT数据库（Lefrance, 2001）分析表明, VH基因符合小鼠IgG V区基因的特征: 含有4个框架区（FR）, 3个抗原互补决定区（CDR）及两个抗体特征性的半胱氨酸。结论: 成功地克隆了迟缓爱德华菌抗独特型mAb VH基因, 为进一步构建迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定了基础。
[关键词]迟缓爱德华菌; 抗独特型抗体; 基因克隆; 序列分析
迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda) 是淡、 海水养殖鱼类的一种最主要的病原菌[1], 具有很强的致病性, 其感染具有流行面积广、 发病率及死亡率高等特点, 是水产养殖业中危害最大的一种疾病。该菌的宿主范围较广泛, 常能从多种冷血动物、 鸟类、 温血脊椎动物及环境中分离出[2], 可引起人类的各种感染（胃肠炎、 败血症、 肝脓肿、 脑膜炎、 伤口感染等）。临床表现为腹泻、 水样便、 伴呕吐、 腹痛及低热等。此外, 亦有报道迟缓爱德华菌可引起肝脓肿、 脑膜炎及软组织感染等的报道[3]。目前, 国内对该菌的仍然是应用各类抗生素等药物, 如在饵料中添加适量的土霉素、 四环素、 庆大霉素、 氯霉素、 呋喃唑酮和磺胺类药物等, 并定期用福尔马林药浴。但长期应用抗生素易产生耐药性和药物残留等负面影响[4, 5]。欧、 美等国家已有将弧菌、 气单胞菌及爱德华菌等制成灭活疫苗, 并从中提取多糖、 胞外蛋白等有效抗原, 制备了单克隆抗体（mAb）工程疫苗, 且已商品化生产。由于灭活疫苗的抗原性较弱, 而减毒疫苗的安全性不稳定, 为此, 研制使用方便、 高效、 易商品化大规模生产、 切实有效的疫苗, 对水产业甚为必要。我们首次从分泌抗迟缓爱德华菌独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）中提取总RNA, 并以RTPCR成功克隆了该mAb的VH基因。
1 材料和方法
1.1 材料 分泌抗迟缓爱德华菌独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）为本室建立[6]。RPMI1640干粉为Gibco BRL公司产品。RNA抽提试剂TRIzolTMReagents购自TaKaRa公司。RTPCR试剂盒为美国Invitrogen公司产品。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒, 均购自北京博大泰克公司。PCR试剂, 连接试剂和pBSTvector均购自北京天为时代公司。
1.2 方法 迟缓爱德华菌抗独特型mAb VH基因的扩增: 复苏分泌抗迟缓爱德华菌独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）, 传至3代使细胞数目达2.8×107/L后收获细胞。用TRIzolTMReagents、 氯仿和异丙醇抽提RNA后, 以无水乙醇沉淀。以11 μL RNA为模板, 以Oligo（dT）20为随机引物, 反转录合成cDNA第1链。PCR引物序列: Back: 5′ATGAAATGCAGCTGGGGCAT(C,G)TTCTTC3′; For: 5′CAGTGGATAGACAGATGGGGG3′。在25 μL反应体系中, 加入cDNA 2 μL, Back和For引物各1 μL进行PCR。反应参数为: 于94℃变性5 min后, 94℃、 1 min, 50℃、 1 min, 72℃、 1 min, 共25次循环后, 于72℃再延伸10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 RTPCR扩增产物的鉴定 经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定表明, VH基因的RTPCR产物大小为420～500 bp（图1）。
图1 mAb 1E11 VH基因RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
1: DL 2000 DNA marker; 2: VH基因的RTPCR产物.
2.2 VH基因的克隆及序列分析 将PCR扩增的VH基因胶回收后, 克隆入pBSTvector载体中, 并转化E.coli DH5α的感受态细胞中, 经Xgal蓝白筛选后, 挑取阳性克隆, 经菌落PCR鉴定正确后进行测序。测序结果经IMGT数据库（Lefrance, 2001）分析显示, VH基因具有小鼠IgG VH基因的特征, 含有3个CDR区, 4个FR区和两个抗体特征性的半胱氨酸 (图2)。
图2 抗迟缓爱德华菌独特型mAb VH 基因的核苷酸及推导的氨基酸序列（略）
3 讨论
克隆得到正确的抗体轻、 重链可变区基因, 是制备基因工程抗体中最重要也是最关键的一步。由于在RTPCR而得到的杂交瘤细胞株的cDNA中, 一些非复制的重排片段是最佳的PCR模板; 而且在进行细胞融合时可能融合不止一个脾细胞至骨髓瘤细胞, 从而导致多种功能性以及非功能性V区基因发生。因此在做PCR克隆抗体轻、 重链可变区基因时, 可能会克隆出除目的基因以外无关的轻重链基因。另外, 由于V区基因内部的5′端和3′端的突变可能会抑制引物退火而阻碍扩增反应。因此我们采用了抗体重链可变区基因5′端的信号肽, 及3′端恒定区的通用引物, 通过NCBI/BLAST/N和IMGT数据库（Lefrance,2001）将PCR出的基因序列进行分析, 找出抗体重链可变区的基因序列, 并在机上进行Blast综合分析, 经过以上研究工作的反复论证, 以确保抗体重链可变区基因的完整和准确。结果, 通过Blast分析未见相同序列。我们得到的抗体重链可变区VH基因共编码113个氨基酸, 序列中无终止密码子, 为一开放读框; 具有4个FR, 3个CDR和维持抗体V区空间结构所必需的2个特征性的半胱氨酸, 分别位于第22位和第96位, 为VDJ重排, 符合小鼠IgGVH基因特征。同源性分析表明, 我们所得到的VH基因与GenBank中序列号为M13832.1(Identities 96%)和U88672.1(Identities 93%)序列相似性较高, 它们均为小鼠重链可变区基因。迟缓爱德华菌抗独特型mAb重链可变区VH基因的成功获得, 为制备新型、 有效的迟缓爱德华菌抗独特型基因工程抗体奠定了基础。
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[1] Amandi A, Hiu SF, Rohovec JS, et al. Isolation and characterization of Edwardsiella tarda from fall chinook salmon(Oncorhynchus tshawytscha)[J]. Appl Environ Mcrobiol, 1982, 43: 1380-1384.
[2] White FH, Simpson CF, Williams LE Jr. Isolation of Edwardsiella tarda from aquatic animal species and surface waters in Florida[J]. J Wildl Dis, 1973, 9: 204-208.
[3] Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, et al. Bergey’s manual of determinative bacteriology[M]. (Ninth Edition), Baltimore, Williams and Wilkins, 1994: 190-194, 253-274.
[4] 张晓君, 战文斌, 陈翠珍, 等. 牙鲆迟钝爱德华菌感染症及其病原的研究[J]. 水生生物学报, 2005, 29（1）: 31-37.
[5] Aoki T, Eguas S, Watanbe T. Detection of R Bacteria in a cultured marine fish yellowtail (Seriola quinqueradiaza)[J]. Jap Microbiol, 1983, 17: 7-12.
[6] 金晓航, 黄威权, 夏永娟, 等. 抗迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 水生生物学报, 2005, 29（3）: 340-343.
