人血管生长素的真核表达及亚细胞定位
作者：张宏斌, 武婕, 杨太成, 冼江, 赖晃文, 杨传红, 郑文岭
【关键词】 人血管生成素;,真核表达;,定位;,细胞核
[摘 要] 目的: 建立人血管生成素（angiogenin, ANG）的真核表达系统并在细胞内亚定位。方法: 采用亚克隆技术构建重组荧光真核细胞表达质粒pEGFP/ANG, 然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并对转染细胞内pEGFP/ANG的表达用荧光显微镜和免疫组化染色进行鉴定。用共聚焦显微镜和免疫电镜观察ANG的亚细胞定位。结果: 荧光显微镜观察可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光。免疫组化染色检测显示, 转染的HUVEC中有棕色颗粒。共聚焦显微镜及免疫电镜检查显示, ANG集聚于细胞核区。结论: 以构建的重组体pEGFP/ANG转染HUVEC后, 可表达人ANG蛋白; 表达的ANG定位于细胞核区。
[关键词]人血管生成素; 真核表达; 定位; 细胞核
血管生成素（angiogenin, ANG）是一种相对分子质量(Mr)为14100、 pI为9.5、 由123个氨基酸组成的蛋白质, 存在于正常人的血浆及实体肿瘤组织中, 属于核糖核酸酶超家族成员[1] , 其基因定位于14号染色体的q11区。ANG具有很强的促进血管生成的作用。大量研究表明, ANG与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系[2, 3], 肺癌、 胰腺癌及乳腺癌等患者的外周血中ANG的水平明显升高, 而且血清ANG的水平与这些肿瘤的及转移呈显著的正相关, 因此, 通过检测血清ANG的水平可预测肿瘤的发生与发展情况[4-6]。然而, ANG对于创伤、 烧伤及血循环较差的股骨头、 半月板等损伤的修复则具有较大的临床应用价值。为此, 我们构建了人ANG基因的真核表达质粒, 并转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行表达, 鉴定了其亚细胞定位。
1 材料和方法
1.1 材料 荧光标记试剂盒为Molecular Probes 公司产品。鼠抗Golgi 58K或Calnexin单克隆抗体（mAb）为Sigma公司产品。EcoRⅠ、 BamHⅠ为Promega公司产品。荧光质粒pEGFP/C2购自Clontech公司。T4 DAN连接酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。Lipofectamine2000为Invitrogen公司产品。DMEM培养液为Gibco公司产品。金标记的羊抗鼠IgG抗体为美国ZYMED公司产品。质粒抽提试剂盒为上海博彩生物科技有限公司产品。抗人ANG mAb由本室制备[7]。脐静脉内皮细胞（HUVEC）为本室保存。其他生化试剂购自华美生物工程公司等。
1.2 方法
1.2.1 人ANG基因的真核表达 构建含有人ANG全长基因序列的原核质粒pBV220/ANG, 用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后, 回收并纯化400 bp 的ANG cDNA片段。将pEGFP/C2质粒以同样的酶酶切处理后, 将ANG cDNA片段和酶切处理的pEGFP/C2质粒在T4 DAN连接酶的作用下连接, 构建重组质粒pEGFP/ANG, 并转化Ecoli JM103感受态细胞[8]。用质粒抽提试剂盒提取重组质粒pEGFP/ANG, 在Lipofectamine2000介导下转染HUVEC。继续培养转染的细胞, 在荧光显微镜下观察转染细胞中荧光的表达。收集转染的HUVEC, 固定、 石蜡包埋切片后, 进行SP法免疫组化染色。
1.2.2 ANG表达的定位 （1）共聚焦显微镜定位: 将表达ANG的HUVEC, 依次经36 g/L中性甲醛固定、 1 mL/L Triton100透明及100 mL/L小牛血清封闭后, 分别加Alexa Fluor555标记的鼠抗Golgi 58K或抗Calnexin mAb标记相应的细胞器(高尔基体58K或内质网), 再加36 g/L中性甲醛固定, 加Hoechst染核, 用共聚焦显微镜观察结果。（2）免疫电镜定位: 收集表达ANG的HUVEC, 加20 g/L戊二醛固定后, 超薄切片并置于镍网, 加50 mL/L H2O2作用10 min, 用生理盐水淋洗。加200 mL/L羊血清封闭5 min后, 依次滴加1∶1000的鼠抗人ANG mAb（4℃孵育20 h、 室温2 h, TBS淋洗及羊血清封闭5 min）及1∶200的金标记的羊抗鼠IgG（室温2 h, TBS淋洗、 双蒸水淋洗并干燥）。然后再分别加50 g/L醋酸铀染色5 min（双蒸水淋洗）及30 g/L枸橼酸铅染2 min（双蒸水淋洗）, 干燥后在电镜下观察结果。
2 结果
2.1 人ANG的真核表达[8] 在荧光显微镜下, 可见pEGFP/ANG质粒转染的HUVEC出现绿色荧光, 而未转染的细胞则不显示荧光(图1)。转染72 h后, 用SP法免疫组化染色检测ANG基因的表达显示, 重组质粒pEGFP/ANG转染的HUVEC胞质中充满了棕色颗粒; 而空质粒转染的细胞中, 细胞全部呈蓝色（图2）。
2.2 ANG在HUVEC中的定位 （1）共聚焦显微镜观察: 在共聚焦显微镜下, 可见ANGGFP融合蛋白与HUVEC的细胞核区相重叠, 与高尔基体及内质网无重叠（图3）; 而单独的GFP蛋白是分布于整个细胞的。（2）透射电镜观察:透射显微镜下观察, 可见HUVEC核的核仁区有浓集的金颗粒, 在细胞核区的其他部位也有少数散在的金颗粒; 而在细胞质及其他细胞器部位均未见金颗粒（图4）。
图1 ANG在HUVEC中表达的荧光显微镜观察（×200）（略）
A: pEGFP/ANG转染的HUVEC; B: 未转染的HUVEC.
图2 ANG在HUVEC中表达的免疫组化（SP法）染色检测（×200）（略）
A: pEGFP/ANG转染的HUVEC; B: 空质粒转染的HUVEC.
图3 表达的ANG在HUVEC中定位的共聚焦显微镜观察（×1000）（略）
图4 表达的ANG在HUVEC中定位的透射电镜观察（×60000）（略）
3 讨论
ANG通过与血管内皮细胞表面的受体结合, 可激活胞内的第二信使, 诱导细胞进入及组织中新生的管状结构形成（即新生的血管分支）等[9, 10], 从而实现其促进血管生长的作用。血管的形成是组织修复与生长必不可少的重要环节, 因此, ANG的促血管生长作用对组织工程学的具有重大的推动作用。已有报道[10], ANG可改善微循环, 在血循环较差的半月板纤维软骨的修复, 以及在梗塞或损伤的组织中重建侧枝循环等过程中, 也发挥着重要的作用。本研究中, 我们以重组质粒pEGFP/ANG转染HUVEC后, 观察了ANG的瞬时表达。由于所用真核表达载体中带有报告基因EGFP, 因此, 在荧光显微镜观察下, 经重组质粒转染的HUVEC中可观察到绿色荧光, 而未经转染的细胞则不显示荧光。同时, 我们用免疫组化（SP法）染色检测表明, pEGFP/ANG重组质粒能够在HUVEC中表达, 为进一步开展ANG基因转移在组织工程学中的应用奠定了一定的基础。透射免疫电镜及共聚焦显微镜观察显示, ANG在HUVEC中定位于细胞核区, 为通过阻断ANG肿瘤的研究提供了一定的实验依据。
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