套层细胞淋巴瘤细胞系中染色体13q31?q32上miR?17?92基因簇的DNA序列研究
作者：徐卫，李建勇，沈秋丹，李丽，于慧
【摘要】 为了研究B细胞淋巴瘤的染色体13q31?q32上miR?17?92基因簇的特点，观察B细胞淋巴瘤中miR?17?92基因簇在基因组DNA水平上是否存在改变，及其对miR?17?92基因簇的表达和与淋巴瘤发生关系的影响。应用PCR和DNA序列测定技术检测Rec1、G519和Z138三个套细胞淋巴瘤（mantel cell lymphoma，MCL）细胞系中染色体13q31?q32上miR?17?92基因簇。结果表明，3个MCL细胞系的miR?17?92基因簇DNA序列与正常人的序列比对完全一致。由此可以认为，MCL细胞系中miR?17?92基因簇在DNA序列上没有异常改变，不是miR?17?92基因簇的过度表达原因。
【关键词】 淋巴瘤
DNA Sequencing of miR?17?92 Cluster at Chromosome 13q31?q32 in Mantel Cell Lymphoma Cell Lines
Abstract This study was aimed to explore the characteristics of miR?17?92 cluster at chromosome 13q31?q32 in B cell malignant lymphoma and to investigate the changes of miR?17?92 chuster in B cell lymphoma at genome DNA level and its influeuce on expression of miR?17?92 cluster and relation with lymphoma occurence. PCR and DNA sequencing were used to detect miR?17?92 cluster at chromosome 13q31?q32 in mantel cell lymphoma (MCL) cell lines Rec1, G519 and Z138. The results showed that DNA sequence of miR?17?92 cluster at chromosome 13q31?q32 in MCL cell lines were normal. It is concluded that there is no abnormal change in DNA sequence of miR?17?92 cluster which is not the mechanism for miR?17?92 cluster overexpression in mantel cell lymphoma cell lines.
Key words miRNA; miR?17?92 cluster; lymphoma
微小RNA(miRNA)是一种大小19-25个核苷酸组成的单链小分子RNA，由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过切酶(Dicer)加工后生成［1］。miRNA在线虫、果蝇、小鼠和人等多个物种中被广泛发现，在人类已经发现有300多种miRNA，这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。人类染色体13q31?q32上存在5个miRNA的前体(miR91?precursor?13 miRNA、miR18? precursor?13 miRNA、miR19a?precursor?13 miRNA、miR19b?precursor?13 miRNA和miR92?precursor?13 miRNA)和7个成熟miRNA (miR?17、miR?91、miR?18、miR?19a、miR?20、miR?19b和miR?92)的miR?17?92基因簇，而比较基因组杂交（CGH）研究结果显示，B细胞淋巴瘤，尤其是套层细胞淋巴瘤（mantel cell lymphoma，MCL）（包括MCL细胞系Rec1）染色体13q31?q32区域有扩增［2］。为进一步了解其在DNA序列上miR?17?92基因簇的改变，我们应用PCR和DNA序列测定技术对3个MCL细胞系中染色体13q31?q32上miR?17?92基因簇进行研究。
材料和方法
细胞系
MCL细胞系 Rec1、G519和Z138，均由英国Leicester大学Martin Dyer教授惠赠。此3种细胞
基金项目：“江苏省医学领军人才”项目资助和江苏省基金资助项目，编号BK2007249
通讯作者：李建勇，主任、主任医师. 电话：（025）83718836-6550.传真：（025）83718836-6260. E?mail:
2007-03-26 收稿；2007-07-12 接受
系均存在t(11;14)(q13;q32)异常。
Rec1细胞的核型 43,XY,del(2)(q14q35), der(7)dup(7)(p22)inv(7)(p12q21), t(3;8)(q24;p11),i(8)(p10),t(9;22)(p11;q11),t(9;?17)(q23;q?11),t(11;14)(q13;q32),der(12)t(8;12) (p13;q11),?15,?17,?22,add(22)(q13)。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)套层细胞淋巴瘤细胞系中染色体13q31?q32上miR?17?92基因簇的DNA序列研究G519细胞的核型 43,XX,der(1)(14qter→14q11::1p34→1p21:: 1q10→1q12::12q12→12q23),der(9)(9q31→9q34::12q23→12q11::9p11→9qter),t(11;14)(q13; q32),?12,der(13)(14q32→ 14q24::13q14→13q10::13q10→13qter),?14,dic(17;18)(q10;q10),trp(18) (q11q23),der(20)t(17?;20)(q21;p11)。
Z138细胞核型 51,XY,+der(1)t(1;15)(p11;q11), +der(7)del(7) (q32),t(8;14)(q24;q32),der(11)del(11)(q14q25),t(11;14)(q13;q32)+del(12)(q22q24),+13,t(14;18) (q32;q21),i(17)(q10),+der(18)t(14;18)(q32;q21)。
采用10%胎牛血清RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2及恒定湿度条件下培养。采用LNS缓冲液裂解细胞，经碘酚抽提法提取DNA。
miR?17?92基因簇的PCR扩增
miR?17?92基因簇全长约737 bp，为便于DNA序列测序，设计两对引物进行PCR扩增，两PCR产物末端有部分重叠。下列为miR?17?92基因簇序列图，深色斜体为miR?17?92基因簇：
第1对引物，上游：5′?TCAAAGTGCTTACAG TGCAGGT?3′；下游：5′?CCAGGCAGATTCTAC ATCGAC?3′。扩增产物大小为426 bp。
第2对引物，上游：5′?CTGATGGTGGCCTGC TATTT?3′；下游：5′?ACAGTGGAAGTCGAAATCT TCAG?3′。扩增产物大小为496 bp。
两对引物进行PCR扩增的反应体系为50 μl：DNA模板1 μl，10×PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 4 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，各引物（10 μmol/L）1 μl，Taq DNA聚合酶1 U。
扩增条件为：94℃ 2分钟；94℃1 分钟，58℃ 1 分钟，72℃ 1 分钟，共32个循环；72℃ 10 分钟，4℃保存。
不加DNA模板为空白阴性对照，正常人胎盘组织为阳性对照。
DNA序列测定
扩增后的产物采用QIAquick Gel Extraction kit（Qiagen公司产品）进行纯化，然后对纯化的DNA扩增产物进行DNA序列测定。
结 果
PCR扩增miR?17?92基因簇
MCL细胞系Rec1、G519和Z138的DNA经两对引物PCR扩增后分别在426 bp和496 bp处可见清晰的阳性条带（附图）。
DNA序列测定
PCR扩增产物经胶纯化后进行序列测定，序列结果进行序列比对（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）与正常人染色体13q31?q32上miR?17簇的序列完全一致，未见异常变化，说明MCL细胞系Rec1、G519和Z138的DNA序列测定miR?17簇在基因组DNA水平上的没有异常改变。讨 论
真核生物中存在两种非编码RNA（non?coding RNA），一类为小干扰RNA（siRNA），另一类为微小RNA(miRNA)。miRNA的主要功能是调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达［3］。miRNA对目标靶基因进行转录后调节，它们通过依赖于miRNA和靶基因的互补性的两种不同的机制反向调控靶基因的表达［4，5］。
miRNA可视为潜在的原癌基因或肿瘤抑制物［6，7］。在弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、滤泡淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）和MCL等肿瘤中常有13q31?q32位点的扩增。而在这一扩增区域的唯一的基因就是一个非编码蛋白的RNA：C13orf25，这个转录本编码了miR?17?92基因簇，其中包含了miR?91、miR?17、 miR?18、miR?19a、miR?20、miR?19b和miR?92这7个miRNA［2］。He等［8］运用基因芯片技术，发现前体miR?17?92簇和成熟miR?17?92簇在B细胞淋巴瘤患者样本和细胞系中均过度表达，推测miR?17?92基因簇过度表达与淋巴瘤的发生、有关。O′Donnell等［9］证明,miR?17?92基因簇是一组可能的肿瘤相关的基因，发现Myc诱导了miR?17?92的表达，在Myc存在的情况下，miR?17?92基因簇中的miRNA限制了E2F1的活性，通过阻断Myc和E2F1的正反馈循环削弱了Myc对于细胞增殖的影响。miR?17?92基因簇所起的作用是抑癌基因的作用，这与He等［8］人的发现是相反的。
miR?17?92基因簇的抑癌基因和癌基因的多重特点表明了肿瘤发生的复杂性和miRNA调控基因表达的复杂性。CGH研究结果显示,B细胞淋巴瘤，尤其是MCL，染色体13q31?q32区域有扩增。为进一步了解MCL中miR?17?92基因簇在基因组DNA序列上是否存在改变，从而影响miR?17?92基因簇的表达和与MCL发生的关系，我们应用PCR和DNA序列的测定技术对3个在13q31?q32位点的扩增MCL细胞系中miR?17?92基因簇进行了研究，结果发现Rec1、G519和Z138 3个MCL细胞系的miR?17?92基因簇DNA序列与正常人染色体13q31?q32上miR?17?92基因簇的序列完全一致，没有异常改变，基因组DNA序列不是miR?17?92基因簇的过度表达的原因，有关这方面的实验结果，未见国外的相关报道。关于miR?17?92基因簇在B细胞淋巴瘤发病机制中的作用有待进一步研究。
近年来miRNA在恶性疾病中的作用引起研究者极大的关注，一些特异的miRNA表达与肿瘤密切相关，随着研究的深入，miRNA在肿瘤发病机理方面的作用将被进一步阐明，将为肿瘤的开辟一条新的途径。
【】
1徐卫, 李建勇, 陆凤翔. 微小RNA及其在恶性淋巴增殖性疾病中的研究进展. 实验血液学杂志,2006;14:840-844
2Ota A, Tagawa H, Karnan S, et al. Identification and characterization of a novel gene, C13orf25, as a target for 13q31?q32 amplification in malignant lymphoma. Cancer Res,2004;64:3087-3095
3Krek A, Grun D, Poy MN, et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet, 2005; 37: 495-500
4Chen PY, Meister G. microRNA?guided posttranscriptional gene regulation. Biol Chem, 2005; 386:1205-1218
5Thomson JM, Newman M, Parker JS, et al. Extensive post?transcriptional regulation of microRNAs and its implications for cancer. Genes Dev, 2006; 20:2202-2207
6Zhang B, Pan X, Cobb GP, et al. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Dev Biol, 2007; 302:1-12
7Kent OA, Mendell JT. A small piece in the cancer puzzle: microRNAs as tumor suppressors and oncogenes. Oncogene, 2006; 25:6188-6196
8He L, Thomson JM, Hemann MT, et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature, 2005; 435（7043）:828-833
9O′Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, et al. c?Myc?regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature, 2005; 435（7043）:839-843??
