外源性Wnt5a诱导K562细胞分化表型的实验研究
作者：袁媛，司维柯，李招权，潘静，赵宸
【摘要】 本研究探讨外源性Wnt5a诱导K562细胞定向分化的作用。用重组腺病毒AdWnt5a、AdGFP感染CHO细胞，分别制备Wnt5a和GFP对照条件培养液，并处理K562细胞1-7天，用光学显微镜和显微镜观察细胞形态变化；采用过氧化物酶（POX）、糖原（PAS）和非特异性酯酶（α?NAE）染色、细胞表面分化抗原CD13、CD14、CD68鉴定K562细胞的分化表型；用流式细胞术检测细胞分化周期的变化。结果表明： 与对照GFP条件培养液相比，Wnt5a条件培养液处理的K562细胞形态和超微结构均出现了分化成熟的特征；POX、PAS、α?NAE细胞化学染色均为阳性，并且α?NAE阳性70％可被氟化钠抑制；单核细胞系表面标志抗原CD14、CD68和粒细胞系表面标志抗原CD13经免疫细胞化学染色均呈阳性，但CD13与对照比较无显著性差异；Wnt5a处理K562细胞5天，细胞周期阻滞在G2期。结论： 外源性的Wnt5a可诱导K562细胞向成熟方向分化，并且有向单核细胞系分化的现象。
【关键词】 诱导分化
Differentiation Phenotypes of K562 Cells Induced by Exogenous Wnt5a
Abstract This study was aimed to investigate the effect of exogenous Wnt5a on directional differentiation of K562 cells. Wnt5a and GFP condition mediums were prepared by recombinant adenoviral vector AdWnt5a and AdGFP transfecting CHO cells. K562 cells were treated with Wnt5a and the GFP condition mediums for 1-7 days as Wnt5a treated group and control group respectively. The morphological changes of K562 cells were observed by light microscope and electron microscope; the differentiation phenotypes of K562 cells were identified by the cytochemical staining of POX，PAS，α?NAE and immunocytochemistry of CD13,CD14, CD68, and the effect of Wnt5a on cell cycle distribution of K562 cells was detected by flow cytometry. The results showed that the morphology and ultrastructure of K562 cells treated by Wnt5a displayed differentiation mature feature; both POX and PAS staining showed higher positive ratio in Wnt5a treated group than that in control group; the α?NAE staining also was positive， but positive intensity in Wnt5a treated group could be inhibited up to 70％ by NaF. The expressions of monocytic differentiation antigens of CD14, CD68 in Wnt5a treated group were higher than those in control group， but the expression differences of granulocytic differentiation antigen CD13 between Wnt5a treated group and control group were not significant. The cell cycle in treated group was blocked at G2 phase as compared with control group. It is concluded that exogenous Wnt5a can induce K562 cells to differentiate towards mature and K562 cells treated with Wnt5a displays features of differentiation towards monocytic lineage.
Key words Wnt5a； K562； induction differentiation； Wnt signaling
J Exp Hematol 2007; 15(5):946-949
Wnt家族在个体发育及一些恶性肿瘤的发生、中起到重要作用［1,2］。Wnt5a属于Wnt家族成员之一，近年来报道它也与肿瘤的发生密切相关［3］，但与白血病的关系报道较少。我们前期的研究发现， Wnt5a在急性、慢性髓系血病患者的外周血或骨髓以及一些髓系白血病细胞株中均表达缺失或降低，并且外源性的Wnt5a可抑制K562细胞增殖并有诱导其分化的现象。在此基础上，本研究旨在进一步确证外源性Wnt5a有诱导K562细胞定向成熟分化的作用，以揭示Wnt5a在白血病的发生、发展中的作用和机制，为白血病的诊断和提供新的诊断标志物和基因治疗靶点。
材料和方法
主要试剂
外源性Wnt5a诱导K562细胞分化表型的实验研究RPMI 1640培养液（美国Gibco公司产品），小牛血清（杭州四季青生物材料研究所产品），小鼠抗人CD13、CD14、CD68单克隆抗体（北京中衫生物技术公司产品），二甲亚砜、胰酶（美国Gibco公司产品）。
细胞培养
人红白血病细胞株K562、 仓鼠卵巢细胞株CHO为本试验室保存，均置于10％热灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中,在37℃、5％ CO2条件下培养。
AdWnt5a、AdGFP条件培养液的制备
AdWnt5a、AdGFP由美国芝加哥大学分子肿瘤研究室何通川教授赠送，构建方法见［4］。接种CHO细胞于6孔板，使汇合度达60％, 分别加入AdWnt5a和AdGFP各5 μl，培养16-48小时检测荧光，根据荧光强度在48-72小时收集培养液约6 ml, 即为Wnt5a、GFP条件培养液， -4℃保存备用。
Wnt5a诱导K562细胞分化实验
K562细胞浓度为106/ml，于6孔板中，每孔加入2 ml Wnt5a、GFP条件培养液、1 ml K562细胞悬液，培养K562细胞1-7天，每天收集细胞用于下述实验。
K562细胞分化形态学观察
分别用Wnt5a、GFP条件培养液处理K562细胞1-7天，每天收集细胞，离心后对涂片进行瑞氏染色，在光学显微镜下观察细胞形态变化。处理K562细胞2、5天，收集细胞离心，用PBS洗涤2次后，2.5％戊二醛固定，常规制备电子显微镜检的超薄切片，透射电子显微镜下观察超微结构的变化。
Wnt5a诱导K562细胞分化的细胞化学染色
细胞化学染色方法见文献［5］。收集处理1、3、5、7天的K562细胞，涂片固定，进行POX、PAS、α?NAE染色及氟化钠抑制试验，用光子显微镜观察。POX染色以细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性；PAS染色以细胞质中出现红色或紫红色，呈弥散状、颗粒或块状为阳性；α?NAE染色以细胞质中有灰黑或黑色弥漫性或颗粒状沉淀为阳性。在低倍镜下观察全片染色情况，转到高倍视野（10×40），随机观察10各视野，计数每个视野的细胞数，阳性细胞百分率，α?NAE染色用NIS?Eements RB软件测定平均光密度值并计算平均数，结果与GFP组比较，进行统计学处理。
Wnt5a诱导K562细胞分化时细胞表面分化抗原检测
收集处理1、3、5天的K562细胞，离心涂片进行免疫细胞化学染色，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，CD13、CD14、CD68阳性结果判定：光子显微镜下观察，胞浆中呈棕黄色者为阳性细胞，每例随机选出10个不重复、不重叠的高倍视野（10×40），计数每个视野的细胞数，阳性细胞百分率，结果与GFP组比较并做统计学处理。
Wnt5a诱导K562细胞分化时细胞周期的变化
Wnt5a、GFP条件培养液分别处理K562细胞1、3、5天，细胞终浓度为1×106/ml，离心收集细胞，用PBS洗涤2次，70％预冷乙醇固定，RNA酶消化，碘化丙锭（PI）室温染色30分钟后，上流式细胞仪检测，分析得出处理1、3、5天的K562细胞周期各时相的比例。
统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，数据以±SD表示。
结 果
Wnt5a诱导K562细胞的形态及超微结构变化
光子显微镜下观察，Wnt5a条件培养液处理5天的K562细胞与对照细胞比较，显示细胞体积缩小，核浆比减小，核染色质浓缩，核仁减少或消失，有的核出现了凹陷（图1C），并且出现了个别典型单核细胞形态的细胞（图1D）。显微镜下观察，Wnt5a处理的细胞的细胞核内异染色质增多，电子密度增大，核仁减小，或变小，胞质增多，核浆比减小，内质网、高尔基体、核糖体、线粒体等明显增多，并随处理时间的延长成熟形态特征更明显（图2） 。
Wnt5a诱导K562细胞分化的细胞化学染色
与对照相比， Wnt5a条件培养液处理5-7天的K562细胞，其POX、PAS细胞化学染色阳性率均显著提高，第7天POX染色阳性率为15.51%，对照为10.07％；PAS为37.68%，对照为21.58％，统计学分析两者有显著性差异（表1）。α?NAE染色阳性，并且70％以上能被氟化钠抑制， Wnt5a条件培养液处理的K562细胞的α?NAE染色平均光密度值为31.5，氟化钠抑制后为10.5，对照K562细胞α?NAE染色平均光密度值为21.75，氟化钠抑制后为18.75，两者有显著差异(图3)。
Wnt5a诱导K562分化时细胞表面抗原标记
利用免疫细胞化学染色法检测细胞表面分化抗原CD13、CD14、CD68，并计算阳性率。结果显示： Wnt5a处理3-5天的K562细胞，单核细胞系表面标志抗原CD14、CD68阳性率明显高于GFP对照组，统计学分析二者有显著性差异（p＜0.01），粒细胞系表面分化抗原CD13表达的增强与对照组比较无统计学意义（p﹥0.05）（表2）。
Wnt5a诱导K562细胞的细胞周期变化
K562细胞分别用条件培养液处理5天，GFP处理组细胞的G1期细胞为41.53%，S期为53.19%，G2期为5.27%，这表明K562细胞处于增殖旺盛状态。Wnt5a处理组细胞G1期为34.47%，S期为48.57%，G2期为16.95%，处理组与对照组K562细胞相比G2期增高了2.22倍，提示Wnt5a作用5天，能将细胞阻滞在G2期，使细胞不能进行正常的有丝分裂，从而抑制了细胞的增殖（表3）。
讨 论
Wnt5a与其他Wnt家族成员一样在个体发育中不可缺少，但与肿瘤的关系至今不明确。有报道提出Wnt5a可调节细胞增殖，导致肿瘤的发生。但又有报道认为，Wnt5a可抑制细胞增殖，并且在一些肿瘤组织中表达缺失［6］。李招权等［7］研究发现： Wnt5a在急性、慢性髓系白血病患者的骨髓或外周血中表达缺失或降低，仅1例完全缓解的病例Wnt5a表达为强阳性，并且在髓系白血病细胞株K562、HL?60细胞中表达缺失，与报道相一致。他们的研究表明，外源性的Wnt5a可抑制K562细胞生长并诱导其向成熟方向分化，提示Wnt5a缺失可能与髓系白血病的发生密切相关［7］。本研究在此基础上，进一步确证了外源性Wnt5a是诱导K562细胞成熟分化以及定向分化的表型。
实验研究表明，Wnt5a条件培养液处理的分化的K562细胞，与对照相比，随着处理时间的延长，其恶性表型逐渐减弱，并出现成熟表型，如胞浆量增多，细胞器增多，核浆比减小，核仁减少或消失，核出现了凹陷扭曲。POX、PAS染色是临床常用于鉴别急性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等白血病类型的实验方法。α?NAE又称"单核细胞酯酶"，幼单核细胞、单核细胞和原始粒细胞α?NAE染色均可呈阳性反应，单核细胞的阳性可被氟化钠抑制，粒细胞阳性不被氟化钠抑制，因此被临床常用于鉴别单核细胞和粒细胞白血病。Wnt5a处理的K562细胞，POX、PAS染色与对照相比阳性率增高，α?NAE染色阳性并可被氟化钠抑制，抑制率大于70％。Wnt5a处理组单核细胞系表面标志抗原CD14、CD68阳性率明显增高，但粒细胞系标志抗原CD13表达与对照组比较无统计学意义。这些结果均提示，外源性的Wnt5a诱导K562细胞向成熟方向分化，Wnt5a处理的K562细胞具有向单核细胞系分化的特征。在G2期，一些与有丝分裂相关的蛋白质，如微丝、微管蛋白、有丝分裂因子等合成结束，为有丝分裂作准备。Wnt5a诱导K562细胞5天时，细胞周期阻滞在G2期， Wnt5a可能影响有丝分裂，使细胞不能增殖，从而抑制了细胞恶性增殖，故Wnt5a可能是一种抑癌基因［8］。
总之，结合我们既往的研究及本实验的结果，发现Wnt5a在急性、慢性髓系白血病细胞及髓系白血病细胞株中表达缺失或降低，外源性的Wnt5a抑制K562细胞增殖，并可诱导其向单核细胞系分化。这些提示Wnt5a的缺失可能与白血病发生有关，其确切的生物学机理不明，还有待进一步研究。
【文献】
1Trends RT, Brown JD, Torres M, WNTs modulate cell fate and behavior during vertebrate development. Trends Genet,1997; 13：157-162
2Wodarz A, Nusse R, Mechanisms of Wnt signaling in development. Annu Rev Cell Dev Biol, 1998; 14：59-88
3Mikels AJ, Nusse R. Purified Wnt5a protein activates or inhibits β?catenin?TCF signaling depending on receptor context. PLoS Biol，2006; 4： e115
4司维柯，何通川.过表达外源CCN1对人骨肉瘤细胞系143B生长和迁移的影响.生物化学与分子生物学报, 2006; 22：565-570
5许文荣主编. 临床血液和血液检验实验指导，北京：人民卫生出版社. 2003：1-13
6Liang H, Chen Q, Coles AH,et al. Wnt5a inhibits B cell proliferation and functions as a tumor suppressor in hematopoietic tissue.Cancer Cell,2003; 4: 349-360
7李招权，司维柯，潘静等. Wnt5a基因在血液病及白血病细胞株中的表达. 中国实验血液学杂志,2007; 15:927-930
8Leris AC, Roberts RT, Jiang WG, et al. WNT5A expression in human breast cancer. Anticancer Res, 2005, 25: 731-734
