套细胞淋巴瘤一例误诊分析
作者：于慧，徐卫，吴雨洁，程月新，仇海荣，张苏江，盛瑞兰，李建勇
【摘要】 套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是一类较少见的非霍奇金淋巴瘤（non?Hodgkin's lymphoma, NHL），形态学方法常难以将其与其他类型小细胞淋巴瘤相鉴别。为了提高对MCL的认识，报道1例误诊为滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma, FL）的MCL，该病例临床资料及实验室检查特点。结果显示：流式细胞术（flow cytometry，FCM）及免疫组织化学染色检查符合MCL的特征，细胞遗传学检查发现了包括t(11;14)在内的多种染色体异常。结论： MCL为难以确诊的疾病，间期荧光原位杂交、多重荧光原位杂交、FCM以及免疫组织化学染色等检查有助于MCL的诊断。
【关键词】 套细胞淋巴瘤
A Case Report of Misdiagnosed Mantle Cell Lymphoma
Abstract Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare group of non?Hodgkin's lymphoma (NHL), which is difficult to discriminate from other subtype of small lymphocytic lymphoma in morphologic appearance. In order to enhance the understanding of MCL, a case of MCL first diagnosed as follicular lymphoma (FL) was reported. The clinical and laboratory characteristics of MCL were analyzed and summarized. The results showed that the findings of flow cytometry (FCM) and immunohistochemical staining technique were compatible with the diagnosis of MCL. Cytogenetic analysis can detect multiple types of chromosomal abnormalities, including t(11;14). In conclusion, MCL is a disease which diagnosis is difficultly confirmed. Interphase fluorescence in situ hybridization, multiplex fluorescence in situ hybridization, FCM and immunohistochemical staining technique play important roles in the diagnosis of MCL.
Key words mantle cell lymphoma; I?FISH; M?FISH; FCM
套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是1994年于欧美淋巴瘤修订分类（revised European American lymphoma， REAL）中提出的一个独特的病理类型［1］，为较少见的一类非霍奇金淋巴瘤（non?Hodgkin's lymphoma， NHL），占NHL的2％-10％。在Kiel分类中归为生发中心细胞淋巴瘤，在工作分类中归为小细胞与大细胞混合性淋巴瘤或弥漫型小裂细胞淋巴瘤，但不明确的滤泡部分常被误诊为滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma， FL）或反应性淋巴滤泡增生。细胞遗传学特点是t(11;14)(q13;q32)，由11号染色体的Bcl?1基因（11q13）易位到14号染色体免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain， IgH）基因启动子的下游，从而导致Bcl?1基因表达的上调。Bcl?1基因的易位导致细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）mRNA过度表达，最终导致细胞增殖的调控紊乱。临床过程呈进展型，侵袭性强，预后较差，中位生存期为3-5年［2］。近来我科收治1例患者，外院误诊为FL，在我院经过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）以及流式细胞术（flow cytometry， FCM）检测确诊为MCL，现报告如下。
材料和方法
病例资料
患者，男，58岁，2005年1月体检B超发现后腹膜淋巴结肿大。增强CT、MRI显示：两下肺结节影，纵隔淋巴结肿大；腹腔及后腹膜淋巴结肿大，胰腺周围及腹主动脉旁、肝门处见多个大小不等的低回声，周围清晰，最大直径5.9 cm × 5.3 cm，部分内部回声不均，脾脏肿大，膀胱直肠间类圆形软组织影。外院行腹腔淋巴结切除活检术，术后病理检查显示： FL（I级）；免疫组织化学检查显示： CD79α+、CD20+、CD43+，CD3-、Bcl?2+、Bcl?6-、CD10-、CCND1+、CD5-。2005年2月以MACOP（米托蒽醌、阿糖胞苷、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松）方案化疗，2005年3月复查，CT显示两下肺结节絮状影有所进展，纵隔淋巴结仍肿大，转至其他病理切片会诊显示： FL（I级），免疫组织化学检查显示：CD79α+、CD20+、CD43+、Bcl?2+、Bcl?6-、CD10-、CCND1+，背景细胞CD3+、CD5+。2005年3月-2006年1月采用FND（福达华、米托蒽醌和地塞米松）方案化疗，共计8疗程，期间多次复查CT显示部分病灶有所吸收，部分增大，并出现左颈根部、左腋下淋巴结肿大。2005年8月实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)套细胞淋巴瘤一例误诊分析常规骨髓检查未见异常。2006年3月患者出现四肢游走性疼痛，4月复查CT显示：左中下颈、左侧锁骨上及左侧腋窝淋巴结较前增大、增多，两肺浸润灶较前有所缩小，脾肿大。骨ECT显示：两肱骨中段、两股骨中段、左侧坐骨肿瘤骨转移。患者疾病进展，于2006年4月26日转至我院。我院病理报告显示： FL（I-Ⅱ级），入院体检为：轻度贫血貌，皮肤黏膜无瘀点瘀斑，浅表淋巴结未扪及，胸骨无压痛，心肺无异常，腹平软，肝未及，脾肋下2 cm。骨髓细胞形态学：有核细胞增生明显活跃，原始淋巴细胞22.8%，幼稚淋巴细胞10.0%，成熟淋巴细胞4.0%；原幼细胞过氧化物酶（POX）和糖原染色（PAS）染色阴性。外周血白细胞16×109/L，原始淋巴细胞11%，幼稚淋巴细胞11%，成熟淋巴细胞38%，血红蛋白 85 g/L，血小板 160×109/L。
常规细胞遗传学（conventional cytogenetics， CC）分析
取骨髓5 ml肝素抗凝，有核细胞计数后按(1-2)×106/ml进行直接法和（或）短期培养法制备染色体并采用R显带技术进行核型分析。染色体核型按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN 2005）》描述。
间期FISH检测t(11;14)
探针来源 间期FISH探针购自美国Vysis公司。该探针是分别用荧光素SpectrumGreenTM标记的IgH和用SpectrumOrangeTM标记的CCND1探针的混合物。
方法 参照步骤［2］。
结果分析 应用Leica DMRA2型荧光显微镜在DAPI/FITC/TexasRed三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号：无t(11;14)(q13;q32)异常的间期细胞核内出现两个红色信号和两个绿色信号（2R2G）。有t(11;14)(q13;q32)异常的间期细胞核内出现绿色和红色相互靠近或叠加产生的黄色融合信号（F）。每个病例计数200个间期细胞。
M?FISH分析
探针来源 M?FISH探针购自美国Vysis公司。此探针是经流式细胞仪分选、显微切割后经DOP?PCR扩增的全染色体涂抹探针，应用5种荧光素的不同组合经缺口平移法标记，5种荧光素包括SpectrumGoldTM、SpectrumFRedTM、SpectrumAquaTM、SpectrumRedTM和SpectrumGreenTM。
步骤 标本处理、图像采集及分析方法参照文献步骤［3］。
FCM免疫表型分析
取肝素抗凝的新鲜（6小时内）抽取的骨髓，调整细胞数至（0.5-1.0）×106/ml，取100 μl经直接免疫荧光标记法标记，避光15分钟后上溶血剂溶解红细胞。流式细胞仪（Beckman?Coulter公司产品，Epics XL型，USA，488nm激发波长，采用Expo32 ADC分析软件）检测至少10 000个细胞，FS/SS双参数设门，分析淋巴细胞群不同抗原的表达情况，膜单克隆抗体包括有CD5、CD19、CD20、CD23（购自法国Immunotech公司）。结果判断以抗原表达≥20％为阳性。
结 果
FCM检测结果
原幼淋巴细胞占39.9%，其表达为CD19+ 90%，二次设门（CD19+细胞表达）CD5+ 89.5%，CD20+ 100%，CD23-。
CC检查结果
92,XXYY,7q+×2,9q+×2,t(11;14)×2,13q+×2,15q+×2［2］/46,XY［8］。
间期FISH检查结果
t(11;14)阳性细胞占24%，其中3R3G3F 16%，4R3G2F 4%，2R2G3F 4%（图1）。
Figure 1. t (11; 14) positive cells shown by FISH.
M?FISH检查结果
综合上述FCM、CC、I?FISH和M?FISH结果，结合外院淋巴结免疫组织化学CCND1+、CD43+、CD10-，诊断此患者为MCL（IV期A组）。于2006年5月初开始Hyper?CVAD A方案（环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、地塞米松）及B方案（阿糖胞苷和甲氨蝶呤）交替化疗，每周期2次腰穿鞘注甲氨蝶呤、阿糖胞苷和地塞米松，共计进行4疗程化疗。5月26日复查骨髓：原幼淋占0.8%。FCM未见微小病灶残留（minimal residual disease， MRD）。FISH 结果：t(11;14)阳性细胞：0/200。2006年8月复查CT显示：左腋窝淋巴结、纵隔淋巴结、腹膜后淋巴结均明显缩小，脾脏亦有所缩小，但仍超过正常大小，肺部病灶明显吸收。
讨 论
MCL因其独特的细胞来源、病理形态、免疫表型和分子生物学特征而成为WHO NHL分类中独立的一种类型。MCL起源于滤泡套内层中未受抗原刺激的CD5+CD23-周围性B细胞，拥有B细胞的免疫标记： CD19+、CD20+、CD22+、CD43+、CD79α+、sIgM+，并过度表达CD5+、FMC7+、Bcl?2+，但CD3-、CD10-、CD23-、Bcl?6-，CD5+有助于MCL与FL区别。CCND1+几乎存在于每例MCL中，而在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）及其它NHL很少见［5］。通过遗传学和免疫学方法检测t(11;14)(q13;q32)和CCND1表达可作为区别MCL和其他小B细胞性淋巴瘤的重要手段［6］。
在MCL、FL、CLL/SLL和边缘区B细胞淋巴瘤等小B细胞淋巴瘤中，组织病形态有时有重叠，而套细胞淋巴瘤对治疗反应性差，5年生存率仅为11%［7］，因此必须与其他小B细胞淋巴瘤作鉴别。有时MCL的结节性病灶极类似于FL的肿瘤性滤泡，单从形态上很难鉴别，因此鉴别两者需把组织学、免疫组织化学和分子遗传学综合考虑。由于免疫组织化学检测易受到多种技术性与人为因素以及抗体特异性与敏感性不足的影响，因此其结果始终是HE组织学改变的辅助与补充，不能脱离组织学改变去评价免疫组织化学检测结果，我们认为免疫组织化学结果与组织学特点相一致才可以肯定。尤其是淋巴瘤的诊断，最基本的是确切、充分的组织学依据，免疫组织化学检测只能作为分型与鉴别诊断的辅助手段。此病例虽然免疫组织化学检测结果CCN1+，但先后两次CD5结果不一致，而淋巴结病理形态与FL高度符合，鉴于上述原因，三家病理科诊断为FL。先后以MACOP方案1次及FND方案8次化疗，均无明显疗效，病情进展，转至我院后FCM显示CD5+、CD19+、CD20+、CD23-、CC、间期FISH和M?FISH检测均有t(11;14)异常，尽管病理学诊断为FL，但结合病史特点以及免疫表型特征和分遗传学结果确诊为MCL。
t(11;14)易位导致了CCND1的表达异常。Monteil等［8］在1996年首次采用间期FISH检测MCL中t(11;14)(q13;q32)。现FISH已经作为国外日常病理辅助诊断MCL的首选方法［9］。PCR只能检测出11q13上主要易位簇（major translocation cluster, MTC）内有限区域上（大约几百个bp）的断裂点，落在距离主要易位簇以外大约100 kb的次要易位簇（minor translocation cluster, mTC）内的断裂点，由于PCR技术上的局限性而不能完整的扩增出如此长的片段。FISH敏感性高的原因是其所用的CCND1探针杂交的目的片段包括了11q13上MTC、CCND1等大约350 kb大小的区域，明显提高了易位检出率［10］。本研究中，骨髓细胞采用FISH检测到t(11;14)(q13;q32)。
间期FISH只能用特异性的探针检测已知的染色体异常，且通常一次杂交只能检测一种至数种染色体异常。M?FISH不仅可以确定CC发现的核型异常，包括染色体易位、大片段缺失、不明来源的额外物质的增加、衍生染色体和标记染色体，而且还可以发现CC分析未发现的异常，纠正CC分析中的错误，对检测未知核型异常很有帮助。本例患者CC与M?FISH检查示近四倍体，染色体条数稍有差别可能和不同的分裂像有关，CC仅见t(11;14)伴7q+,9q+,13q+,15q+,而M?FISH发现了6、7、9、13、14、22号衍生染色体，t(7;9)，t(9;15)，t(3;13)，t(11;14)，t(4;22)易位及11号染色体片段缺失等多种染色体异常，11号染色体片段缺失可能与易位的14号片段丢失或其片段很小有关。
近来人们利用比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）技术显示MCL的基因突变。de?Leenw等［11］用基因芯片技术分析8例MCL细胞系（G519、HBL?2、NCEB?1、Rec?1、SP49、UPN?1、Z138C和JVM?2），结果发现平均每个细胞有35种基因改变，其中14种为基因缺失、21种为基因扩增，18q21/Bcl2和13q31/GPC5异常扩增和9p21缺失多见，重要的是发现了位于2p11和22q11上的免疫球蛋白轻链基因等新的位点的缺失，这些新位点的变化对研究MCL很有意义。Jarosova等［12］利用CGH分析30例确诊的MCL，80%的患者有不稳定的异常染色体变化。常见的缺失有1p、8p、9q、11q、13q和17p，约1/4的病例3号染色体有附加异常。
Ott等［13］用FISH及CC方法研究发现，大约30％的MCL可检测到染色体四倍体克隆，且在母细胞样型MCL出现率明显增高（80％）。由于四倍体染色体异常在其它B细胞NHL现象少见，可作为MCL遗传学特征之一。本研究结果提示，对少见复杂表现的小细胞淋巴瘤可以先借助组织学和免疫组织化学染色来诊断大部分的病例。不能鉴别时，采用FCM检测、间期FISH、M?FISH等方法尤为重要。
Khouri等［14］报道45例MCL患者予Hyper?CVAD方案化疗4周期化疗后总体有效率93.5％，其中完全缓解(CR) 38％，部分缓解(PR)55.5％。所有随后进行移植的患者均达CR。25例初治的患者3年总体生存率(OS)和无事件生存率(EFS)分别为92％和72％，而曾经接受过治疗的患者其OS和EFS则分别为25％和17％。与经典的CHOP类似方案相比， Hyper?CVAD方案的3年EFS及OS亦显著增高。认为Hyper?CVAD方案后进行干细胞移植是治疗初诊MCL患者的有效方案。而Hagemeister［15］认为在年龄小于65岁的患者中，美罗华联合Hyper?CVAD方案与Hyper?CVAD后进行干细胞移植在治疗有效率、疾病无复发以及总体生存率方面类似。本例患者初诊时误诊为FL，外院采用MACOP及FND方案化疗，疗效不佳，且病情进展，侵犯骨髓，我们应用Hyper?CVAD方案取得了较好的近期疗效，目前患者仍在随访中。
【】
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