窄谱中波紫外线对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响
【摘要】 目的 研究窄谱中波紫外线(NB?UVB)对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB?EGF)mRNA表达的影响。方法 用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NB?UVB照射正常人KC后继续培养12h，用MTT法和实时荧光定量RT?PCR法分别检测KC增殖和HB?EGF mRNA的改变。结果 NB?UVB照射正常人KC后,可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HB?EGF mRNA的表达。50mJ/cm2和100mJ/cm2 NB?UVB照射后，分别使KC增殖抑制5.4%和8.7%，使HB?EGF mRNA增加到正常对照组的1.7倍和2.5倍。结论 NB?UVB抑制KC的增殖部分是通过上调HB?EGF的表达介导的。
【关键词】 表皮生长因子；角质形成细胞；窄谱中波紫外线
在亚热带中银屑病少见，并且银屑病有冬重夏轻的特点。这种现象提示温度和日光可能与银屑病的发病有关。自20世纪70年代，临床开始应用补骨脂素?长波紫外线(psoralens plus ultraviolet A, PUVA)银屑病、白癜风等皮肤科疾病，之后用中波紫外线(ultraviolet B, UVB)代替UVA。研究发现310nm左右的紫外线对银屑病的治疗效果最佳，红斑效应相对较小。因此，滤除其他波长紫外线所产生的波长在311nm左右的窄谱中波紫外线(narrow?band UVB, NB?UVB)得以产生并广泛应用于皮肤病的治疗。已证明NB?UVB在银屑病的治疗中比普通UVB疗效更好，相同累积剂量下副作用也较小[1]。当前NB?UVB光疗已广泛应用于银屑病的治疗，疗效肯定，但其治疗机制尚不完全清楚。 肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparin?binding epidermal?growth?factor?like growth factor, HB?EGF)与转化生长因子?α(transforming growth factors?α, TGF?α)、双向调节因子和表皮调节素等生长因子相互作用，通过旁分泌形式调节角质形成细胞(keratinocyte, KC)的增殖和分化。HB?EGF先以跨膜形式(proHB?EGF)合成，其外功能区脱落后形成游离形式(sHB?EGF)的HB?EGF。proHB?EGF可抑制细胞的生长，而sHB?EGF 是KC、纤维母细胞、平滑肌细胞等多种细胞的有丝分裂原。在表皮增生性皮肤病如银屑病、基底细胞癌、鳞状细胞癌中，HB?EGF的表达升高[2?4]。HB?EGF在KC生长和分化的调节中发挥重要的作用。因此，我们在体外用不同剂量的NB?UVB照射培养的正常人KC，检测其对细胞增殖和HB?EGF mRNA表达的影响。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
KC无血清培养基(KC?SFM)、低糖DMEM、 Dispase酶均购于Gibco公司，依曲替酸(重庆华邦公司)，TRIzol试剂(Invitrogen公司)，RT?PCR试剂盒(MBI公司)，SYBR green 2×PCR master mix(ABI公司)，PCR配套试剂(TaKaRa公司)，NB?UVB光源(Waldmann, 德国)，Centrifuge 5417R高速低温离心机(Brinkmann Instruments Inc)，GeneAmp PCR system 9700(ABI公司)、PRISM 7900 sequence detector(ABI公司)。
1.2 原代KC的培养
取健康人环切术后包皮，消毒液浸泡后，置于2.5g/L Dispase酶4℃消化过夜，次日分离表、真皮，将表皮置于2.5g/L胰酶与0.02g/L EDTA(1∶1)混合液中，消化10min，用含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打后，100目筛网过滤，离心收集细胞，加入KC?SFM，吹打后接种入培养瓶，于37℃、50mL/L CO2条件下培养，次日更换新培养基，以后每3d换液一次，当细胞70%-80%融合时传代，取3-5代细胞进行实验[5]。将实验细胞传代入6孔板中，当细胞90%融合时，用PBS冲洗后，覆盖薄层PBS，然后用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NB?UVB垂直照射KC，照射后换新培养液，继续培养12h，每组设3个孔，并设置未照射的正常对照组。
1.3 MTT
将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NB?UVB垂直照射，继续培养12h。设正常对照组和空白对照组(只加细胞培养液无细胞)。吸出培养液，每孔中加入MTT(5g/L)后再孵育4h，弃上清液后每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min。以空白对照组为基准，在490nm波长处检测吸光度值。生长抑制率(%)=1-A490nm(实验组细胞)/A490nm(对照组细胞)×100%。
1.4 总RNA的提取
按1mL/10cm2(培养瓶面积)加入TRIzol提取总RNA，操作严格按试剂盒说明进行。用12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，用紫外分光光度计测定RNA含量和纯度。
1.5 cDNA的合成
在反应管中加入2μg总RNA、1μL oLigo(dT)18和1mL/L DEPC处理水至12μL，70℃ 5min，加入5×缓冲液4μL，RNA酶抑制剂20u，10mmoL/L dNTP 2μL，37℃ 5min后，加入M?MuLV逆转录酶200u，42℃ 60min，70℃ 10min，冰上冷却，-20℃保存备用。
1.6 实时荧光定量PCR的检测
用10倍比例稀释β?actin基因的PCR扩增产物做相对定量的标准品。β?actin基因PCR反应体系为12.5μL，包括：10×PCR buffer 1.25μL，dNTP 0.8μL，上游和下游引物各0.8μL，r?Taq 0.08μL，cDNA 2μL，加水至12.5μL。反应条件：94℃ 5min，然后94℃ 30s ，55℃ 30s，72℃ 1min，循环40次，最后72℃ 10min，4℃保存备用。实时定量PCR反应体系为25μL，包括：模板cDNA 2μL，ABI SYBR Green 2×PCR master mix 12.5μL，H2O 1μL，上游和下游引物(β?actin或HB?EGF)各1μL。扩增条件为：50℃ 2min，95℃ 10min，然后95℃ 30s，60℃ 1min，循环40次。β?actin上游引物序列：CAGCACAATGAAGATCAAGATCA，下游引物序列：CGTCATACTCCTGCTTGCTGA，产物125bp；HB?EGF上游引物序列：GGCTCCCTCCTGCATCTG，下游引物序列：AGGATGGTTGTGTGGTCATAGGT，产物105bp。在PCR过程中设立无模板阴性对照(no templates control, NTC)。在实验结束后进行溶解曲线分析，以鉴定产物是否单一。
1.7 统计学处理
用2-△△Ct法处理实时荧光定量RT?PCR数据，所得结果即表示目的基因相对于正常对照组所改变的倍数[6]。这种方法可把目的基因归一化(normalization)，以减少由于细胞数和抽提RNA获得率的差异所引起的误差，这里ΔΔCt=(CtHB?EGF-Ctβ?actin)实验组-(CtHB?EG-Ctβ?actin)对照组。Ct(threshold cycle, Ct)值，即临介循环数，在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，其与模板cDNA的起始拷贝数成反比。统计学分析采用SPSS11.5软件进行Dunnett?t检验，P<0.05认为有统计学意义。结果用±s表示。
2 结 果
2.1 总RNA纯度及质量鉴定
经测定A260/280比值在1.7-1.9之间，表明RNA无污染，电泳显示5s、18s和28s三条带，说明RNA完整性较好。
2.2 NB?UVB对KC增殖的影响
NB?UVB可剂量依赖抑制KC的生长，50mJ/cm2和100mJ/cm2 NB?UVB照射后分别使KC的生长抑制5.4%和8.7%(表1)。表1 NB?UVB对KC增殖的影响（略）
2.3 实时荧光定量RT?
PCR检测NB?UVB对HB?EGF mRNA的影响 定量标准曲线的相关系数为0.999，斜率为-3.46，待测标本的Ct值均在标准曲线内，说明所测值可信(图1)。溶解曲线分析无明显非特异峰形成，说明无明显非特异性扩增。NB?UVB可剂量依赖诱导HB?EGF mRNA表达，50mJ/cm2和100mJ/cm2处理后分别使HB?EGF mRNA增加到正常对照组的1.7和2.5倍(图2)。
3 讨 论
正常KC可表达少量的HB?EGF，提示HB?EGF在维持KC的增殖和分化中发挥一定作用。NB?UVB照射后，可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HB?EGF mRNA的表达。实验结果分析表明KC的生长抑制趋势与HB?EGF表达水平相一致，即HB?EGF表达的水平越高，KC的生长抑制越强。临床应用证明，NB?UVB光疗能有效银屑病，但其治疗机制尚不完全清楚。UVB照射后可通过诱导caspases，如caspase 9 和caspase 3的表达而诱导KC的凋亡[7]。有人认为UVB对银屑病的治疗作用是通过诱导KC和T细胞的凋亡而实现的[8]。另外，各种细胞因子和炎性介质的改变也可能发挥一定的作用。UVB照射后皮肤的显微镜下改变包括角化不良、棘层肥厚、海绵形成、炎症细胞浸润，这些都表明UVB照射可影响KC的增殖和分化[9]。在体外，高剂量UVB照射可降低表皮KC的增殖、诱导其正常分化并加速其凋亡，但低剂量UVB无此作用[10]。正常情况下，HB?EGF与ErbB1(又称EGF受体，EGFR)和ErbB4结合，诱导EGFR磷酸化，并启动细胞活化信号，调节细胞的生长，使细胞维持于稳定的增殖分化状态。UVB照射后可激活多种细胞膜受体，包括酪氨酸激酶受体ErbB家族，抑制细胞酪氨酸酶活性后可抑制UVB对人皮肤的影响，抑制UVB诱导的KC凋亡。在用抗ErbB1和抗ErbB2抗体中和ErbB1和ErbB2后，UVB诱导的KC凋亡也减少[11]。因此，作为ErbB1配体之一的HB?EGF，表达增加后与ErbB1和ErbB4结合诱导其磷酸化，可能参与UVB对KC增殖、分化和凋亡的调节。一些研究表明生长因子对细胞生长的调节有双重效应，其既可通过激活丝裂原激活蛋白酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3?kinase, PI?3K)通路促进细胞生长，又可通过信号转导和转录活化蛋白(signal transducers and activators of transcription, STAT)诱导的周期素依赖性蛋白激酶(cyclin?dependent kinase , CDK)抑制物p21waf1和caspase 1而导致细胞生长停滞或死亡 [12?13]。正常情况下，STAT诱导的p21waf1和MAPK活性处于平衡状态，而维持细胞的正常生长[14?15]。当这两种信号途径的平衡状态被破坏时，细胞发生过度生长或凋亡。HB?EGF与EGFR结合后可同时激活生存信号途径和凋亡信号途径。当被激活的生存信号强于死亡信号时，则刺激KC的生长；而激活的死亡信号强于生存信号时，则抑制KC的生长，诱导其凋亡[16]。总之，HB?EGF通过旁分泌与EGFR结合，使EGFR活化，随后激活不同的信号途径，而刺激或抑制KC的生长。总之NB?UVB抑制KC的增殖部分通过上调HB?EGF的表达介导。这对NB?UVB治疗银屑病的机制有一定的提示作用。关于NB?UVB调节KC增殖和分化的分子机制还需进一步的研究。
【】
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