尾加压素Ⅱ促进乳鼠心肌成纤维细胞分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制
作者：宋庆刚，吕建庄，杨竞霄
【摘要】 目的 探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)促进乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制。方法 体外培养CFs，采用免疫组织化学染色法及羟脯氨酸测定法分别观察不同浓度UⅡ作用下，CFs中磷酸化ERK1/2细胞灰度和CFs培养上清中胶原含量的变化；蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrine chloride(Che)、ERK1/2抑制剂PD98059和钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂cyclosporin A(CsA)各自对UⅡ诱导的细胞增殖的影响。结果 在1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L UⅡ作用下，CFs培养上清中胶原含量均较对照组明显增加，而CFs中磷酸化ERK1/2细胞灰度均较对照组有显著降低(P<0.01)；在1×10-7 mol/L UⅡ作用下，上述各参数与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。1×10-6mol/L Che+1×10-8 mol/L UⅡ组、1×10-5mol/L PD98059+1×10-8mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+1×10-8 mol/L UⅡ组的胶原含量均高于对照组而低于1×10-8mol/L UⅡ组(P<0.05)。1×10-6 mol/L Che+1×10-8 mol/L UⅡ组、1×10-5mol/L PD98059+1×10-8 mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+1×10-8mol/L UⅡ组的p?ERK1/2的灰度低于对照组(P<0.01)；1×10-6mol/L Che+1×10?8mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+1×10-8mol/L UⅡ组的p?ERK1/2的灰度高于1×10-8 mol/L UⅡ组(P<0.01)，而1×10-5mol/L PD98059+1×10-8mol/L UⅡ组与之比较则无统计学意义(P>0.05)。结论 UⅡ具有促进CFs分泌胶原及增殖的作用，其作用可能是通过PKC/MAPK/CaN途径实现的。
【关键词】 尾加压素Ⅱ；心肌；成纤维细胞；细胞分裂
尾加压素Ⅱ(urotensin Ⅱ，UⅡ)是一种生长抑素样环形结构的神经肽，最早提取于硬骨鱼的尾部下垂体，1998年首次在人体中克隆成功[1]。UⅡ广泛存在于神经系统和心血管系统，属于神经内分泌肽，其特异性受体为孤儿G?蛋白耦连受体GPR14[2?4]。报道，UⅡ是迄今为止发现的最强的血管收缩剂，比内皮素强10余倍，对心血管系统的调节有着重要的作用。但UⅡ对CFs分泌胶原及增殖的影响及其影响机制尚不清楚。本研究是在体外培养CFs，再采用免疫组织化学染色法及羟脯氨酸测定法，分别观察加入蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrine chloride(Che)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)抑制剂PD98059和钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂cyclosporin A(CsA)对UⅡ诱导的CFs细胞增殖及胶原合成的影响，旨在探讨UⅡ诱导的CFs细胞增殖作用和胶原合成的细胞内信号转导机制，从而在细胞及分子水平上为心肌纤维化的发生提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物、试剂及仪器
SD乳鼠购自本校实验动物中心。 Rat UⅡ、DMEM、DAB显色剂、碘化丙啶、兔p?ERK1/2蛋白多克隆抗体、Che、PD98059和CsA均为Sigma产品；胎牛血清(FCS)购自浙江杭州靖湖犊牛利用研究所；大鼠抗兔二抗ABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；羟脯氨酸含量测定试剂盒购自南京建成生物公司；链霉素抗生物素蛋白?过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒购自福州迈新生物公司；台盼蓝购自西安化学试剂厂。3550型自动酶联检测仪为美国Beckman公司产品，721型可见光分光光度计为上海第三分析仪器厂产品。
1.2 CFs的培养和鉴定
在无菌环境下取出生2-3d的SD仔鼠心室，剪碎，DMEM冲洗，用0.7g/L胰酶消化细胞，每10min收集一次细胞，收集4-6次，筛网过滤，1000r/min离心4-5min，将收集的细胞采用差速贴壁法分离纯化CFs。待CFs生长近融合时以1∶2传代。经倒置显微镜、透射电镜确认，SABC法免疫组化染色，纤维粘连蛋白染色阳性、血管平滑肌肌动蛋白VⅢ因子和结蛋白染色阴性证实所培养的细胞为CFs。实验采用2-4代细胞。
1.3 CFs培养上清中的胶原含量测定
采用羟脯氨酸比色法测定。将对数生长期的CFs用2.5g/L胰蛋白酶消化，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为2.5×107/L，加入96孔培养板，每孔200μL，静置培养至细胞接近融合。加入条件培养液干预，每孔加液体最终达300μL。24h后吸取培养上清50μL，加入玻璃试管中，用考马斯亮兰染色，分光光度计测定吸光度(A)值，上清中的总蛋白含量；再用羟脯氨酸比色法测定相应孔中的A值，根据总蛋白含量及该A值计算出羟脯氨酸含量。
1.4 p?ERK1/2蛋白免疫组化染色
CFs通过免疫组化染色后，将其培养在无菌盖玻片上，分别经各种试剂处理48h后，再用多聚甲醛固定10-15min。固定后的CFs在PBS液中漂洗2次，每次5min，再加入80%(体积分数)甲醇液[含0.3%(体积分数)H2O2]，室温孵育10min，将其内源性过氧化酶的活性抑制。PBS液洗3次, 每次5min，加入正常羊血清，室温孵育5min。PBS液洗3次，每次5min，接着加入兔p?ERK1/2蛋白多克隆抗体，4℃孵育过夜。PBS液洗3次，每次5min，连接生物素标记的二抗，室温孵育10min。PBS液洗3次，每次5min，最后加入链霉素抗生物素蛋白?过氧化酶溶液，室温孵育10min。之后充分用PBS洗玻片3次，每次5min。在新鲜配制的DAB中显色5-10min，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封固。以PBS缓冲液替代一抗作对照染色。显微镜下观察染色细胞并照相，细胞膜有棕黄色颗粒附着为阳性标记。
1.5 实验分组
①不同浓度的UⅡ和Che、PD98059、CsA诱导的UⅡ对CFs培养上清中胶原含量的影响：设基础状态组(对照组)、10-10mol/L UⅡ组、10-9mol/L UⅡ组、10-8mol/L UⅡ组、10-7mol/L UⅡ组；10-8mol/L UⅡ+10-6mol/L Che、10-8mol/L UⅡ+10-5mol/L PD98059、10-8mol/L UⅡ+5μg/mL CsA。②不同浓度的UⅡ和Che、PD98059、CsA诱导的UⅡ对CFs p?ERK1/2灰度的影响：设基础状态组(对照组)、10-10mol/L UⅡ组、10-9mol/L UⅡ组、10-8mol/L UⅡ组、10-7mol/L UⅡ组；10-8mol/L UⅡ+10-6mol/L Che、10-8mol/LUⅡ+10-5mol/L PD98059、10-8mol/L UⅡ+5μg/mL CsA。
1.6 统计学处理
所有实验结果均以均数±标准差(±s)表示，组间差异比较采用多个样本均数比较的ANOVA方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 UⅡ对CFs培养上清中胶原含量的影响
由图1可知，在10-10、10-9、10-8、10-7mol/L UⅡ作用下，CFs培养上清的羟脯氨酸含量分别为(3.90±0.29)、(4.33±0.41)、(8.21±0.23)、(2.65±0.36)μg/mg protein，随着UⅡ干预浓度的增加，CFs培养上清中羟脯氨酸含量呈先增后减趋势。其中，在10-10、10-9、10-8mol/L UⅡ作用下，CFs培养上清中的羟脯氨酸含量均较对照组(2.40±0.35)明显增加，且差异有统计学意义(P<0.01)。在10-7mol/L UⅡ作用下，CFs培养上清中的羟脯氨酸含量与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
由图2可知，10-6 mol/L Che+10-8 mol/L UⅡ组、10-5mol/L PD98059+10-8mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+10-8mol/L UⅡ组的羟脯氨酸含量分别是(4.19±0.21)、(3.66±0.49)、(4.18±0.50)μg/mg protein，均高于对照组的(2.40±0.35)μg/mg protein而低于10-8 mol/L UⅡ组的(8.21±0.23)μg/mg protein，差异有统计学意义(P<0.01)。
由图3可知，在10-10、10-9、10-8mol/L UⅡ作用下，p?ERK1/2的灰度分别为186.93±4.66、172.93±2.45、158.74±2.09，随着UⅡ干预浓度的增加，CFs的p?ERK1/2灰度较对照组(202.91±3.33)明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。在10-7mol/LUⅡ作用下，CFs的p?ERK1/2的灰度(201.99±4.24)与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
由图4可知，在10-6mol/L Che+10-8mol/L UⅡ组、10-5mol/L PD98059+10-8mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+10-8mol/L UⅡ组的p?ERK1/2的灰度分别为185.34±5.62、158.74±2.09、184.54±4.80，均低于对照组(202.91±3.33)；10-6mol/L Che+10-8mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+10-8mol/L UⅡ组的p?ERK1/2的灰度高于10-8mol/L UⅡ组(154.76±6.22)(P<0.01)，而10-5mol/L PD98059+10-8mol/L UⅡ组与之比较差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨 论
CFs不仅在心脏中数量最多，而且是主要合成和分泌心脏细胞外基质的细胞类型，而胶原是细胞外基质最主要的成分。CFs的增殖和胶原合成的增加以及沉积导致心肌纤维化可能是左心室肥厚的主要病理基础。我们采用免疫扩散法可以观察到心肌组织、冠状动脉粥样硬化斑块中脂质沉积的平滑肌细胞和巨噬细胞聚集的区域中含有丰富的UⅡ。UⅡ不仅可以通过上调胆固醇乙酰转移酶?1(ACAT?1)而加速动脉粥样斑块中的巨核细胞源性泡沫细胞的形成[2,5?6]，还可以通过ERK途径促进脐静脉内皮细胞增殖和抑制细胞的凋亡，通过ERK途径和上调炎性因子刺激心肌细胞的肥大[7?8]。这在慢性心力衰竭的心肌重构方面起着重要的作用。另外，UⅡ还可以通过激活NADPH氧化酶，促进肺动脉平滑肌细胞的增殖，从而导致肺动脉高压[9]。但是，UⅡ是否能促进CFs增殖以及其有关信号转导机制，目前尚不十分清楚。本研究结果显示，CFs的p?ERK1/2的灰度在10-10-10-8mol/L UⅡ之间呈浓度依赖性降低，灰度与免疫组化染色的深浅(p?ERK1/2的含量多少)呈相反趋势。由此可见，CFs的p?ERK1/2的含量在10-10-10-8mol/L之间呈浓度依赖性增加，表明UⅡ可使p?ERK1/2表达增加。p?ERK1/2为MAPK的一种类型，主要作用是介导细胞的增殖和肥大[10?11]。在10-10-10-8mol/L UⅡ作用下，随着UⅡ干预浓度的增加，CFs培养上清中的胶原含量均较对照组的胶原含量明显增加，具有统计学意义。以上两点都明确提示UⅡ具有促使CFs增殖和胶原合成的作用。而在10-7mol/L UⅡ组，CFs培养上清中的胶原含量和p?ERK1/2灰度与对照组相比则无统计学意义，说明随着UⅡ浓度的增加，UⅡ促CFs增殖及胶原合成作用减弱。有人在大鼠主动脉缩窄后压力超负荷的心肌肥大模型和大鼠主动脉内膜球囊拉伤后再狭窄模型上发现，心肌浆膜及主动脉内膜的UⅡ受体结合位点上调，而且UⅡ引起血管收缩反应增强[12?13]。有研究表明，高血压病患者的血浆中UⅡ含量升高[14]。由此推测UⅡ促CFs细胞增殖的机制可能是：当血浆中的UⅡ含量升高时，CFs细胞膜上的受体结合位点上调，从而使UⅡ的作用加强；当血浆中的UⅡ含量进一步升高时，受体却产生了耐受性而下调，最后使UⅡ的促增殖作用减弱。UⅡ是一种促动脉平滑肌细胞增生的内源性丝裂原，该效应可能是通过Ca2+、PKC、钙调素依赖的蛋白激酶(CaM?PK)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)来介导[15]；并且UⅡ作用于血管平滑肌细胞后，可通过刺激黏着斑激酶(FAK)的活化，促进细胞的增殖。这种作用并不依赖于细胞骨架蛋白的完整性，而是与PKC介导的信号转导有密切关系[16]。Tamura等[17]证实，整合素介导的信号转导途径在UⅡ诱导的ERK磷酸化过程中起有关键的作用，从而刺激CFs的增殖，而该途径不参与FAK的磷酸化过程。本研究显示，Che、PD98059和CsA对UⅡ诱导的CFs细胞增殖和胶原合成有抑制效应，表明了UⅡ诱导的CFs增殖及胶原合成作用的机制可能有PKC/MAPK/CaN途径的参与，而PD98059对UⅡ诱导的CFs增殖则无抑制作用。这说明PKC和CaN通路可能是通过改变p?ERK的表达来实现增殖效应的，PKC和CaN途径交叉后会形成共同通路通过改变p?ERK1/2的表达而起作用，也就是p?ERK1/2是PKC和CaN途径共同通路的一个中间环节。综上所述，UⅡ可以明显地促进CFs的增殖和胶原合成，UⅡ水平升高可能是加速或启动心脏纤维化的重要因素，并且参与心肌重塑和左室肥厚的形成。而其中的机制可能有PKC/MAPK/CaN途径的参与，各途径之间又具有交叉关系。而至于UⅡ在体内作为一种自分泌或旁分泌因子是否起有该作用尚需做进一步的研究进行证实。
【】
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