大鼠实验性胃溃疡自愈期间肠嗜铬样细胞的变化

            作者：何美蓉，张绍荣，宋于刚，陈学清

【关键词】  胃溃疡

    Change in enterochromaffinlike cells during healing of experimental gastric ulcer in rats

　　【Abstract】  AIM: To investigate the morphologic and functional changes in enterochromaffinlike (ECL) cells during the healing of experimental gastric ulcer in rats. METHODS:  Acetic acidinduced ulcers were caused by application of acetic acid to the serosal surface of the anterior face of the rat gastric bodies. At different time points during ulcer healing, ECL cells, histidine decarboxylase (HDC) mRNA expression and histamine content were studied using immunohistochemical staining, reverse transcriptionpolymerase chain reaction and radioimmunoassay, respectively. RESULTS:  Compared with that in control group, the percentage and the mean gray value of HDCpositive cells in gastric mucosa of ulcer rats decreased immediately on day 1, most markedly on day 6. They began to increase on day 9 and returned to the initial levels on day 12. The HDC mRNA expression in gastric mucosa of ulcer rats decreased on day 1, most markedly on day 6, subsequently rose gradually and almost normalized on day 9. The histamine content in gastric mucosa of ulcer rats also decreased, lowest on day 6 after ulcer induction. CONCLUSION:  ECL cells maybe participate in the regulation of ulcer healing by weakening the function of histamine synthesis.

　　【Keywords】 gastric ulcer; enterochromaffinlike cell; histidine decarboxylase; histamine

　　【摘要】 目的：探讨肠嗜铬样细胞与大鼠实验性胃溃疡自愈的关系. 方法：通过制备大鼠乙酸性胃体溃疡模型，采用免疫组化、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和放射免疫测定的方法，观察溃疡自愈过程中大鼠胃黏膜内ECL细胞形态、组氨酸脱羧酶（HDC）mRNA和组胺含量的变化. 结果：胃溃疡大鼠胃黏膜内HDC阳性细胞率和胞质平均灰度值在制模术后第1日即开始降低，术后第6日达到最低，随后开始回升，术后第12日基本正常. 胃黏膜内HDC mRNA表达在制模术后第1日开始降低，第3日最明显，第6日开始恢复，第9日后接近正常. 制模术后胃黏膜内组胺含量也出现下调，以术后第6日为最低. 结论：ECL细胞可通过减弱其合成组胺的功能，参与胃溃疡自愈的调节过程.

　　【关键词】 胃溃疡；肠嗜铬样细胞；组氨酸脱羧酶；组胺

　　0引言

　　肠嗜铬样（enterochromaffinlike，ECL）细胞是组胺的主要来源细胞，而组胺是胃酸分泌的重要调节因子，采用H2受体拮抗剂阻断组胺H2受体几乎能完全抑制胃酸分泌［1-3］. 大鼠实验性胃溃疡自愈过程中，胃酸分泌自动下调，从而减弱对新生肉芽组织的消化作用，以促进溃疡的修复. ECL细胞在溃疡自愈过程中的变化目前尚不清楚. 我们对大鼠实验性胃溃疡自愈过程中，胃黏膜内组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase, HDC）蛋白和mRNA表达及组胺含量变化进行了动态观察如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性8 wk龄Wistar大鼠36只，体质量200~250 g，其中假手术组6只作为对照组，胃溃疡组30只. 采用乙酸制备大鼠胃体溃疡模型. 制模前禁食24 h，不禁水. 30 g/L戊巴比妥钠1 mL/kg ip麻醉. 上腹部备皮，消毒，取剑突下1.5 cm纵切口暴露胃，纯乙酸25 μL滴于直径5 mm的滤纸上，作用于腺胃前壁浆膜面90 s，用生理盐水20 mL将乙酸冲洗干净，腹壁逐层间断缝合，术后单笼饲养，给予标准饮食和自来水［4］. 假手术组以生理盐水代替乙酸进行以上的所有造模过程. 假手术组处死于制模术后3 d，胃溃疡组处死于术后1，3，6，9和12 d，每次6只. 沿胃大弯剪开大鼠胃壁，PBS液冲洗干净后平铺，将溃疡边缘勾画在玻璃纸上，以便用每小方格1 mm×1 mm的坐标纸估算溃疡面积. 剪取溃疡旁约3 mm×5 mm的组织条，置于40 g/L多聚甲醛溶液中，拟做石蜡块，行HE和免疫组化染色. 剪取溃疡旁约60 mg 的胃黏膜，冻存于-80℃冰箱，一半用于RTPCR检测，另一半用于放射免疫测定.

　　1.2方法

　　1.2.1ECL细胞的免疫组化染色常规石蜡切片分别行HE和免疫组化染色. 采用免疫组化SABC法对ECL细胞进行染色（SP9000免疫组化染色试剂盒由北京中山生物技术有限公司生产)，HDC mAb(由武汉博士德生物工程有限公司生产）. HDC抗体稀释度为1∶50. 用MIPS医学图像分析系统在400放大倍数下，在每张切片的黏膜层内随机选取5个视野，分别统计HDC阳性和阴性细胞数，最后出阳性细胞百分率. 从每张切片中随机选取20个HDC阳性细胞，测定其阳性胞质灰度值，并计算平均灰度值，以反映阳性胞质单位面积内HDC的相对含量.

　　1.2.2RTPCR检测HDC mRNA表达采用Trizol（Invitrogen公司）提取胃黏膜标本的总RNA，以ReverrAidTM 第一链cDNA合成试剂盒（Fermentas公司）进行逆转录，PCR PreMix进行PCR反应. 扩增HDC的引物对为：正义：5′ GACTGGCTGGCGAAGA 3′，反义：5′TCCCTGGCACAGATGG 3′，预计扩增产物为437 bp，PCR反应条件为：95℃ 3 min，94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min共32个循环，72℃ 7 min. 扩增内参βactin的引物对为：正义：5′AACACCCCAGCCATGTACG 3′，反义：5′ATGTCACGCACGATTTCCC 3′，预计扩增产物为253 bp，与HDC同管扩增. PCR产物以含0.5 mg/L溴乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光照下以计算机图像分析系统成像和定量分析［5］.

　　1.2.3酶联免疫法测定组胺含量将胃黏膜标本用分析天平称质量，置于预冷的盛有0.1 mol/L高氯酸500 μL的组织匀浆器中匀浆，5000 r/min 4℃离心15 min，取上清液100 μL 用三蒸水稀释20倍，用ELISA试剂盒（Coulter公司）测定标本中组胺含量. 取标本或标准品100 μL，各加入酰化液及其缓冲液25 μL后立即混匀，在室温下各抗体包被管中加入酰化后的标准品或标本50 μL及示踪剂500 μL作总放射性活度计数（PMCT）的测定. 所有测定管加盖至作放射性活度测定. 2～8℃下孵育18 h后在低于8℃条件下吸干测定管中的液体，再用131I闪烁计数仪对标准品及样本进行测定，并制出标准曲线. 胃黏膜组胺含量表达为μg/g.

　　统计学处理：采用SPSS 10.0软件进行统计分析. 计量资料用x±s表示. 胃溃疡组与对照组的比较用Dunnett t检验. P<0.05为有显著性差异.

　　2结果

　　制模术后1 d，胃体前壁即可见一个直径3~6 mm的溃疡，溃疡呈圆形或椭圆形，中心颜色苍白，边界清楚，周围黏膜充血水肿. 术后3 d溃疡最为明显，溃疡中心可见灰白色苔膜，随后进入愈合阶段，溃疡面积逐渐减小. 光镜下观察，术后3 d坏死黏膜脱落形成明显溃疡，黏膜腺体消失，炎性细胞浸润，6 d可见上皮细胞向溃疡中心移行，9 d溃疡边缘可见新形成的扩张的腺体，12 d溃疡处胃壁结构逐渐完成再生，黏膜及黏膜下层近似正常.

　　2.1ECL细胞的变化HDC免疫反应阳性的ECL细胞主要位于胃黏膜的下1/3，基底膜附近，腺体的外周，为一种形状不规则的小细胞. 制模术后1 d，胃黏膜内HDC阳性细胞百分率和胞质平均灰度值即开始降低，术后6 d达到最低，随后开始回升，术后12 d与对照组无显著性差异（Tab 1，Fig 1）.表1实验性大鼠胃溃疡自愈过程中HDC阳性ECL细胞百分率和胞质灰度值的变化（略）

　　2.2胃黏膜HDC mRNA的表达正常大鼠胃黏膜内可检测到较多量的HDC mRNA表达. 制模术后1 d胃黏膜内HDC mRNA表达出现下调，3 d最为明显，6 d开始回升，9 d后基本恢复正常（Fig 2）.

　　2.3胃黏膜组胺的含量对照组大鼠胃黏膜内组胺含量为（31.6±3.8）μg/g. 制模术后3 d胃黏膜内降低至（23.2±2.4）μg/g(P<0.01)，6 d达最低（20.1±3.2）μg/g (P<0.01)，9 d开始恢复，12 d恢复至（32.4±3.5）μg/g. 制模术后3，6和9 d胃黏膜组胺含量明显低于对照组，差异有显著性. 制模术后1，12 d胃黏膜组胺含量与对照组无明显差异.

　　3讨论

　　ECL细胞释放的组胺是胃酸分泌的重要调节因子. ECL细胞胞质内的HDC是组胺生物合成唯一所需的酶. 组胺通过弥散作用到达壁细胞，与壁细胞膜上的组胺H2受体结合，刺激胃酸分泌［6，7］. 我们采用HDC mAb对ECL细胞进行免疫组化染色，显示ECL细胞主要位于胃体的下1/3黏膜层，基底膜附近，腺体的外周，为一种形状不规则的小细胞，与Zanner等［2］报道一致. 胃溃疡的愈合是一个肉芽组织填充黏膜缺损及溃疡边缘发生增殖的复杂过程. 在实验性大鼠胃溃疡自愈过程中，即使不给予任何干预，胃酸分泌功能也可发生自发性抑制，其原因目前尚不清楚. 我们通过研究ECL细胞发现制模术后1 d大鼠胃体即出现明显溃疡，3 d溃疡最为明显，12 d溃疡基本愈合. ECL细胞免疫组化染色显示，制模术后1 d，HDC阳性细胞百分率和胞质平均灰度值即开始降低，术后6 d降至最低，随后开始回升，术后12 d基本恢复正常，该结果表明制模术后ECL细胞的数量及胞质内HDC蛋白表达都有所下降. 胃黏膜HDC mRNA表达的RTPCR检测及组胺含量的ELISA检测结果，均进一步证实在实验性大鼠胃溃疡愈合过程中，ECL细胞合成组胺的功能减弱. 此外，我们还注意到胃黏膜组胺含量的变化稍滞后于HDC mRNA和蛋白表达的变化，提示制模术后ECL细胞首先出现HDC表达的下调，然后下调的HDC再引起组胺分泌的减少.

　　【】

　　［1］ Zanner R, Hapfelmeier G, Gratzl M, et al. Intracellular signal transduction during gastrininduced histamine secretion in rat gastric ECL cells［J］. Am J Physiol Cell Physiol, 2002；282: C374-C382.

　　［2］ Zanner R, Gratzl M, Prinz C. Circle of life of secretory vesicles in gastric enterochromaffinlike cells［J］. Ann N Y Acad Sci, 2002；971: 389-396.

　　［3］ 曹义战，刘莉，王伯良，等. 两类胃酸分泌抑制剂治疗急性消化性溃疡出血的比较［J］. 第四军医大学学报，2001；22（9）：790-792.

　　Cao YZ, Liu Li, Wang BL, et al. PPI vs H2A-which is stronger inhibitor on acute peptic ulcer bleeding? ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2001；22（9）：790-792.

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　　［5］ 陶开山，窦科峰. 人肝癌组织中EGF，TGFΑ及其受体EGFR mRNA的表达［J］.第四军医大学学报，2004；25（9）：833-835.

　　Tao KS, Dou KF. Expression of EGF,TGFα and EGFR Mrna in human hepatocellular carcinoma［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（9）：833-835.

　　［6］ Prinz C, Zanner R, Gratzl M. Physiology of gastric enterochromaffinlike cells［J］. Annu Rev Physiol, 2003；65:371-382.

　　［7］ Lindstrom E, Eliasson L, Bjorkqvist M, et al. Gastrin and the neuropeptide PACAP evoke secretion from rat stomach histaminecontaining (ECL) cells by stimulating influx of Ca2+ through different Ca2+ channels ［J］. J Physiol, 2001；535: 663-677.