肺炎克雷伯菌超广谱β

          作者：程训民，张琪，徐元宏，李敏，朱素珍，沈继录

【关键词】  ,肺炎克雷伯菌

    Detection of extendedspectrum betalactamases and analysis of antibiotic resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae

　　【Abstract】  AIM: To study the phenotype and genotype distribution of extendedspectrum betalactamases (ESBLs)producing Klebsiella pneumoniae（K. pneumoniae）and its drug resistance. METHODS:  Seventyseven strains of K. pneumoniae were determined by 1999 NCCLs methods and the genotype of ESBLs was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The antibiotic susceptibility of bacteria was determined by microdilution. RESULTS:  In the 77 positive K. pneumoniae isolates of the initial screen test, 45 strains (58.1%) were confirmed by cefotaxime and cefotaximeclavulanic acid but only 27 strains were confirmed by ceftazidime and ceftazidimeclavulanic acid. PCR showed that TEM, SHV, CTXM or OXAtype ESBLs in the clinical strains were 19, 8, 36, 11 strains respectively. CONCLUSION:  K. pneumoniae is one of the most common ESBLsproducing strains. The rates of ESBLsproducing K. pneumoniae significantly increase in recent years and CTXM is most common genotype. Some strains carry two or more genotypes. Imipenem is the most susceptible antibiotic.

　　【Keywords】 Klebsiella pneumoniae; betalactamases; phenotype; genotype; drug resistance； antibiotic

　　【摘要】 目的：了解产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌的表型和基因分布及对常用抗生素的耐药情况. 方法：用1999年NCCLS推荐的初筛试验从77株肺炎克雷伯菌中筛选出可疑产ESBLs细菌，并用确证试验加以确认；用PCR的方法扩增其基因型；用微量液体稀释法做药敏实验. 结果：将初筛得到的可疑菌株用纸片扩散法确证，用头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸测定，77株肺炎克雷伯菌中共检出45株产ESBLs （58.1%）；而用头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸检测ESBLs阳性菌为27株. PCR扩增基因型阳性结果为TEM型 19株、SHV型8株、CTXM型36株、OXA型11株. 结论：近年来肺炎克雷伯菌产ESBLs率显著升高；基因型以CTXM型为主，有些菌株同时携带多种耐药基因；亚胺培南仍为首选药物, 头孢哌酮/ 舒巴坦、哌拉西林/ 他唑巴坦为候选药物.

　　【关键词】 肺炎克雷伯菌; β内酰胺酶类; 表型;  基因型; 耐药性;抗菌药物

　　0引言

　　超广谱β内酰胺酶(extended spectrum betalactamases, ESBLs）是由质粒介导的能使细菌对三代头孢菌素类、青霉素类及单酰胺类抗生素耐药的一类酶，ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌为代表菌属. 近年来，肺炎克雷伯菌产ESBLs菌株逐年增多，ESBLs在菌株间的转移和传播［1］，使其耐药性成为突出问题. 我地区产ESBLs肺炎克雷伯菌的检测结果及耐药性分析如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　肺炎克雷伯菌77株来自200302/200411淮北市人民、淮北矿工总院、濉溪县医院疑为感染患者血液、骨髓、浆膜腔穿刺液、脑脊液、尿液和前列腺液等. 质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922, 肺炎克雷伯菌ATCC700603，标准产酶Eco菌株TEM1，TEM3，SHV5，CTXM3，CTXM24，TOHO1， OXA1，OXA2和OXA10均由安徽医科大学徐元宏副教授惠赠. 药敏试验采用微量液体稀释法,ESBLs检测采用头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松纸片进行初筛, 确证试验采用头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸纸片、药敏培养基（MuellerHinton琼脂）均购自Oxiod公司 . 根据GenBank公布的blaTEM，blaSHV，blaCTXM和blaOXA的DNA序列设计合成8对特异性引物，均由上海生物工程公司合成. PCR扩增试剂盒购自大连宝生生物公司.

　　1.2方法

　　选用头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松药敏纸片，用MH琼脂35℃ 18 h观察结果，按NCCLS标准进行判断［2］. 凡头孢他啶的抑菌圈直径≤22 mm,头孢曲松≤25 mm,氨曲南或头孢噻肟≤27 mm为可疑ESBLs菌株. 每批试验均用大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603做质控. 按标准纸片扩散法用CAZ和CAZ/clav，CTX和CTX/clav两组纸片做确证试验，含克拉维酸与其相应不含克拉维酸的纸片抑菌圈直径差值≥5 mm，确定为产ESBLs菌株. 采用德国Biometra公司DNA扩增仪及大连宝生生物工程公司PCR反应试剂盒进行DNA扩增. PCR反应体积为50 μL含1×PCR缓冲液，3.5 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，500 nmol/L引物，1 U Taq酶，10～50 ng待测DNA模板. 反应参数为开始5 min 94℃解链，继以94℃ 30 s解链，退火温度依据引物不同为56～62℃ 30 s，再以72℃延伸1 min，循环35次，最后72℃保温7 min. PCR扩增产物用12 g/L凝胶（含0.2 mg/L溴化乙锭）电泳，在Tanon102凝胶成像系统下分析结果. 设Eco ATCC 25922及空白为阴性对照，标准产酶Eco（TEM1，SHV5，CTXM3，CTXM24，TOHO1，OXA1，OXA2和OXA10）分别为阳性对照.

　　2结果

　　2.1ESBLs表型和基因检测肺炎克雷伯菌77株共检出产ESBLs 45株(58.1%). PCR扩增结果显示,TEM型阳性19株,SHV型阳性8株,CTXM型阳性36株(Fig 1),OXA型阳性11株.

　　2.2药敏试验产ESBLs肺炎克雷伯菌45株对哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低, 亚胺培南也较低. 氨曲南、庆大霉素、阿米卡星低于头孢噻肟、头孢哌酮和四代头孢菌素头孢吡肟(Tab 1).表1ESBLs阳性肺炎克雷伯菌45株药敏试验（略）

　　3讨论

　　由于第三代头孢菌素的大量使用，肠杆菌科细菌ESBLs的产生率显著增高并广泛传播［3］. 本结果显示，77株肺炎克雷伯菌共检出45株产ESBLs(58.1%). 由于某些ESBLs使细菌对所有β内酰胺类抗生素高水平耐药，但另外一些ESBLs仅使细菌对部分药物选择性低水平耐药，所以检测底物的选择将直接影响ESBLs的检出，本地区头孢噻肟的耐药率高于头孢他啶和氨曲南，可能与本地区大量使用头孢噻肟而较少使用头孢他啶及细菌产CTXM酶有关.  本地区检测ESBLs的最佳底物是头孢噻肟.

　　研究表明，目前ESBLs的基因型主要分四类: TEM型、SHV型、CTXM型、OXA型及其他. 据国内报道，我国的ESBLs的基因型大都为TEM1型广普酶. 本文结果显示，45株肺炎克雷伯菌ESBLs阳性株的基因型分别为TEM型阳性19株,SHV型阳性8株,CTXM型阳性36株,OXA型阳性11株. 因此本地区产ESBLs绝大多数是CTXM型β内酰胺酶, 值得注意的是TEM，SHV，CTXM和OXA型基因双阳性及三阳性的比率较高，原因可能为: ① 质粒上有2种或2种以上ESBLs的编码基因［4］; ② 产ESBLs菌株同时产TEM1，TEM2或SHV1型广谱酶［5］. 这一现象有待于将来进一步深入探讨.

　　产ESBLs肺炎克雷伯菌对除亚胺培南、头孢西丁和哌拉西林/三唑巴坦（他唑巴坦）外大部分抗生素的耐药率均有不同程度的增高，但不同地区之间有所不同［6］. 本结果显示，产ESBLs肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率最低均小于4%，对氨基糖苷类如阿米卡星的耐药率也较低，与耿燕等［7］报道基本一致，这是由于亚胺培南和阿米卡星对克雷伯菌属中产ESBLs的菌株以及阴沟肠杆菌中产诱导酶的菌株有效. 其中对亚胺培南耐药的菌株来源多为重症监护病房（ICU）的患者，这可能与其大量使用的抗菌素有关. 四代头孢菌素头孢吡肟的耐药率和三代头孢菌素头孢噻肟、头孢哌酮相差不大，未能证实或认同四代头孢比三代头孢更稳定. 氨曲南耐药率低于头孢吡肟和头孢噻肟，可能是由于本地区临床上应用较少的缘故. 产ESBLs肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素耐药，即使体外药敏试验为敏感的第三代头孢菌素，亦有可能在时产生耐药；此外，产酶菌对大部分常用抗生素，如β内酰胺类、喹诺酮类等亦不敏感，造成了治疗上的困难. 在抗菌药物的选择上，虽然不同型别ESBLs的耐药谱有所差别，如SHV，TEM型对头孢他啶水解能力较强，而CTXM型高度水解头孢噻肟，但国外多项研究均认为，对于产ESBLs细菌感染，不论体外药敏结果是否敏感，原则上均要避免使用非联合酶抑制剂的第三代头孢菌素，可首选碳青霉烯类，发生耐药的几率较小，疗效较好，并且对已产生交叉耐药的多重耐药菌株有强大抗菌作用［8］. 以哌拉西林/他唑巴坦为代表的联合酶抑制剂的β内酰胺类抗生素临床疗效较好，在广泛使用后并未导致耐药菌株的流行. 国内研究表明头孢哌酮/舒巴坦的敏感率较高，可考虑使用，但由于某些类型的ESBLs，如TEM，SHV类ESBLs中的某些型别可以水解酶抑制剂，故需要警惕耐酶抑制剂菌株的产生；此类药物与氨基糖苷类联合使用疗效较好.

　　【文献】

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