生长抑素类似物对人肝癌细胞株MHCC97

         作者：孙昊，宋涛，张梅，刘青光，潘承恩

【关键词】  MHCC97

　　Influence of somatostatin analogue on human hepatocellular cancer cell line MHCC97H

　　【Abstract】  AIM:  To study the influence of somatostatin analogue octreotide on human hepatocellular cancer cell line MHCC97H and its mechanisms in vivo. METHODS: Twentyseven nude mice,of which MHCC97H tumor mass was planted in liver, were divided into 3 groups randomly: negative control group, low dose interfered group, large dose interfered group,and raised at similar condition for 35 d the survival time , the weight at the death point were racorded and the pathologicail changes of livers and lungs were changed; the expression of matrix metalloproteinases2（MMP2）in hepatocellular carcinoma was detected by immunohistochemical technique. RESULTS: Compared with the animal models of negative control group, the animal models of interfered groups were heavier in mean weight at death point and lower in metastasis rate (P<0.05); while there was no  statistical difference between the 2  interfered groups (P>0.05); the expression of MMP2 in hepatocellular carcinoma of interfered groups was gradually increased than that in control group（P<0.05）; while there was no statistical difference between interfered groups(P>0.05). CONCLUSION: Octreotide can improve the living quality of animal models and inhibit the metastasis of human hepatocellular cancer cell line MHCC97H in vivo,which might be related to the downregulation of the expression of MMP2.

　　【Keywords】 MHCC97H, octreotide, inhibition

　　【摘要】 目的：探讨生长抑素类似物奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H的影响及可能机制. 方法：  MHCC97H肿瘤组织种植于裸鼠肝脏建立肝癌动物模型27只，随机分为3组：阴性对照组和小、大剂量干预组，同等条件下饲养35d，记录动物模型生存期，死亡时质量；观察肝脏，肺脏病理改变；免疫组化方法检测肝脏肿瘤组织基质金属蛋白酶2(MMP2)表达变化. 结果： 奥曲肽干预组动物模型较阴性对照组动物模型死亡时平均体重增加,肝癌转移率下降(P<0.05)；干预组间对比未见统计学差异(P>0.05)；免疫组化显示干预组肝脏肿瘤细胞MMP2表达较阴性对照组下调（P<0.05）；干预组组间比较未见统计学差异(P>0.05).  结论： 奥曲肽可改善荷MHCC97H细胞裸鼠肝癌模型生存质量，抑制MHCC97H细胞肺转移，下调肿瘤组织MMP2的表达是奥曲肽抑制MHCC97H细胞侵袭转移的可能机制之一.
 
　　【关键词】 MHCC97H细胞株；奥曲肽；抑制

　　0引言

　　原发性肝细胞肝癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC)PHC根治性切除后5 a复发率为54.1%～61.5%，小肝癌(≤5 cm)为43.5%，而局部的转移复发率则更高. 常规化疗及放疗效果不佳，副作用大，基因治疗、生物治疗等作用亦不明显. 因此，深入研究肝细胞癌转移、复发机制和积极探索有效的抗复发转移治疗措施是当前PHC诊治中的重点和难点.

　　1材料和方法

　　1.1材料主要试剂和仪器:善宁注射液(0.1 mg/支)由瑞士诺华公司生产提供. 鼠抗人MMP2抗体Antibody Diagnostica Inc.
 
　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H由上海中山肿瘤研究所购得，100 mL/L胎牛血清（fetal calf serum, FCS）加达尔伯克改良伊格尔培养基（dulbeccos modified eagles medium, DMEM）于50 mL细胞培养瓶内37℃，50 mL/L  CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内培养.
 
　　1.2.2动物模型取对数生长期MHCC97H肝癌细胞株，充分吹打至单细胞悬液，细胞冲洗液冲洗3次，DMEM调整细胞浓度至2×107/mL，取0.2 mL于4～6周龄的雄性裸鼠背部皮下注射，实验动物于层流室内饲养28 d，至皮下结节直径约1 cm，无菌条件下取出肿瘤组织保存于37℃含20 g/L FCS的DMEM中，粉碎至2 mm×2 mm×2 mm. 4～6周龄的雄性裸鼠30只，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉后，手术野皮肤消毒，左肋缘下斜切口进腹，显露肝左叶，肿瘤组织块2 mm×2 mm×2 mm大小，接种于肝左外叶，压迫止血，关腹. 同等条件下，动物模型层流室内饲养3 d，剔除因麻醉意外、感染及出血死亡动物模型3只，余动物模型随机分为3组，动物模型体质量及周龄组间均衡性检验无统计学差异.  A组：阴性对照组（等体积生理盐水腹腔注射，n=8）；B组：小剂量干预组（Oct  50 μg/kg・d腹腔注射，n=9）；C组：大剂量干预组（Oct  200 μg/kg・d腹腔注射，n=10），同等条件下层流室内饲养35 d.
 
　　1.2.3标本检测记录每只动物模型生存时间，死亡时体质量，取肝脏，肺脏40 g/L多聚甲醛，0.1 mol/L磷酸缓冲液固定48 h，组织石蜡包埋，HE染色，免疫组化方法检测对比组间肝脏肿瘤组织MMP2表达变化. 染色结果判定参照Mattern方法［1］： 阳性染色深度:未见染色为0，轻度染色(染成浅黄色)为1，中度染色(染成棕黄色)为2，深度染色(染成棕褐色)为3；阳性细胞百分比:未见染色为0，染色细胞<25%为1，25%～50%为2，>50%为3. 将这两方面得分相加，得分0～2分判为阴性表达，>2分(3～6)判为阳性表达，随机选择10个高倍视野，记数1000个细胞.
 
　　统计学处理： 实验计量结果以x±s表示,计量资料组间比较经SAS软件进行方差分析及Dunnett检验，计数资料组间比较采用Fisher确切概率法.

　　2结果

　　人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H种植于裸鼠皮下，层流室饲养35 d后发现原注射点皮下形成约1.1×0.9  cm包块，实验动物呈现衰竭状态. 动物模型建立后，待实验动物清醒，观察3d后，实验动物活动灵敏，觅食积极，并未发现因出血和感染死亡动物. 动物模型建立后10 d发现阴性对照组动物模型较干预组动物模型活动减少，同时发现对照组动物模型死亡时体重明显减轻（P＜0.01），生存时间组间对比未见统计学差异（P>0.05）,但是大剂量干预组动物模型中位生存期较小剂量干预组延长（26.7~21.5 d），同时小剂量干预组动物模型中位生存期较阴性对照组延长（21.5~19.3 d）.
 　　
　　肝脏病理改变可见两种类型. A型肉眼见裸鼠肝体积明显减小，色泽晦暗，质地变硬，表面满布1~2 mm大小结节，呈“粟粒”样，与正常肝脏组织分界不清. 镜下见裸鼠肝细胞大量变性坏死，组织结构消失，正常肝小叶结构消失，残存裸鼠肝细胞肿胀，胞浆内气球样改变，水肿明显；肿瘤细胞胞核淡染，异型性明显，聚集成团，呈现“癌巢”状，可见肿瘤细胞侵入管型结构. B型肉眼见裸鼠肝变化不明显，色泽鲜红，质地柔软，光滑，与正常肝脏组织分界明显. 镜下见坏死区范围明显缩小，肿瘤细胞呈现“癌巢”改变，裸鼠残存肝细胞肿胀坏死明显减轻. 肺脏病理改变：肺泡结构完整，肺泡间质内可见炎性细胞聚集，并可见肺泡间质内肿瘤细胞聚集成团，胞核淡染，异型性明显.
 　　
　　阴性对照组87.5%动物模型肝脏呈现“A”型形态改变，干预组77.8%动物模型肝脏肉眼观呈现“B”型形态改变，而且在大剂量干预组出现B型形态改变的动物比例大于小剂量干预组（44.4%~100%）. 肺脏组织连续切片HE染色判断肝癌肺转移率可见阴性对照组转移率87.5%，小剂量干预组转移率33.3%，大剂量干预组转移率10.0%（表1，P<0.05）. 大剂量干预组MMP2表达明显下调，阳性表达肿瘤细胞几乎不可见，在小剂量干预组MMP2表达较大剂量干预组表达上调，可见少量阳性及弱阳性肿瘤细胞，散在分布；在阴性对照组MMP2表达明显较干预组强，可见阳性及强阳性细胞出现. 而干预组间未见统计学差异（表2）.

　　表1组间动物模型一般状况(略)

　　aP<0.05 vs阴性对照.

　　表2MMP2,MMP9在肝癌组织中的表达（略）

　　aP<0.05  vs阴性对照.

　　3讨论

　　HCC的高复发高转移特性严重影响HCC的远期疗效,部分肿瘤在体积很小时就已发生远处转移，临床就诊者多属中晚期，因此如何控制HCC的高侵袭性，降低复发率和转移率是当今HCC的重点. SS及其类似物对肿瘤的抑制作用近来受到关注. Oct为人工合成的生长抑素类似物，临床上发现Oct对多种实体肿瘤存在抑制作用，包括胃癌，肺癌，胰腺癌等［2］. 随着临床研究的进展，Oct被逐步应用于HCC治疗领域，众多实验表明在人肝癌细胞表面存在SSTR表达［3］，而且这一现象已被利用于肿瘤的诊断［4-5］.
 　　
　　报道［6］于裸鼠肝内种植MHCC97H细胞株建立肝癌模型，饲养35 d后，肝癌肺转移率高达100%，而且MHCC97H细胞株体外连续培养传代120余代，生物性状保持稳定，是研究肝癌复发转移的良好模型. 试验中发现在组间均衡性检验未见统计学差异以及同样的饲养条件下，阴性对照组动物模型肝癌肺转移87.5%，明显高于小剂量干预组(33.3%)和大剂量干预组(10.0%)，Oct对肝癌肺转移存在抑制作用.
 　　
　　MMP2在癌组织内表达于肝癌细胞胞浆内，呈淡黄色至棕褐色细颗粒状. MMP2阳性细胞常散在分布，也有呈巢团状，在浸润灶前沿处MMP2表达加强，阳性及强阳性细胞数目增多. 而位于肿瘤边缘、近血管处、浸润灶前沿等处肿瘤细胞常是高侵袭性克隆聚集处，提示MMP2可能于高侵袭性克隆中表达加强. 在组间比较中发现阴性对照组MMP2表达明显强于干预组，干预组组间比较未见统计学差异； MMP2主要降解作为基底膜的主要成分的Ⅳ型胶原、同时也具有降解明胶、Ⅶ和Ⅹ型胶原的能力，MMP2的异常高表达与肿瘤的恶性程度和肿瘤的血管生成呈正相关，二者均与肿瘤的生长转移密切相关，Oct可以降低动物模型肝癌转移率，可能通过下调促转移相关蛋白MMP2的表达得以实现，是其抑制HCC远处转移的机制之一［7］.

　　【文献】

　　［1］ Mattern J, Koomagi R, Volm M. Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral mieroveSSal density and tumoral proliferation in human epidermoid lung carcinoma ［J］. Br J Cancer, 1996, 73(2): 931-934.

　　［2］ Smith AB, Charnley AK, Mesaros EF, et al. Design, Synthesis, and Binding Affinities of PyrrolinoneBased Somatostatin Mimetics ［J］. Org Lett,  2005,7(3):399-402.

　　［3］ Raderer M, Hejna MH,  Muller C, et al. Treatment of hepatocellular cancer with the long acting somatostatin analog lanreotide in vitro and in vivo ［J］. Int J Oncol, 2000,16(6):1197-1201.

　　［4］ Mannavola D, Persani L, Vannucchi G, et al. Different responses to chronic somatostatin analogues in patients with central hyperthyroidism ［J］. Clin Endocrinol (Oxf), 2005, 62(2): 176-181.

　　［5］ AcostaGomez MJ, Muros MA, et al. The role of somatostatin receptor scintigraphy in patients with pituitary adenoma or postsurgical recurrent tumours ［J］. Br J Radiol, 2005,78(926):110-115.

　　［6］ Li Y, Tang Y, Ye L, et al. Establishment of a hepatocellular carcinoma cell line with unique metastatic characteristics through in vivo selection and screening for metastasisrelated genes through cDNA microarray ［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2003,129(1):43-51.

　　［7］ 王贤辉, 陈志南, 郭晓楠,等. CD147 分子与MMPs在肝癌细胞系中表达的相关性［J］. 第四军医大学学报,2001; 22(3) : 217-219.