川芎嗪对结扎犬LAD损伤冠脉内皮及心肌的保护作用

        作者：何维来，陈如坤，周汝元

【关键词】  心肌保护

    Protective effect of tetramethlpyrazine on coronary artery endothelium and cardiac muscle after LAD ligation

　　【Abstract】 AIM: To explore the protective effect of tetramethlpyrazine on the endothelium and cardiac muscle after acute infarction induced in dogs by ligating the left anterior descending coronary artery (LAD). METHODS:  Fortyfive aged healthy crossbred dogs (15±7) kg were divided into 3 groups: tetramethlpyrazine (TMP) group, verapamil (Ver) group and control group. The operation was performed to ligate the near part of the LAD through left minimal thoracic incision to block 75% of the blood flow respectively. The expression changes of endothelium derived factors NO, ET1, sPselectin and CTnT before ligation and at different time points after ligation were detected and Pselectin gene of cardiac muscle was determined by Western blotting. RESULTS:  The difference was significant among the 3 groups at different time points after ligating LAD  (P<0.01). The expression of Pselectin of cardiac muscle was highly upregulated after ligation in Ver group and control group. CONCLUSION:  Tetramethlpyrazine can effectively restrain the injury of ischemia and reperfusion on endothelium of coronary artery and myocardial cells after ligating LAD and mitigate the stenosis of coronary artery and myocardial infarction, thus preventing the restenosis of coronary artery after coronary artery bypass graft.

　　【Keywords】  endothlial cells; myocardial protection; ligustrazine;  coronary stenosis

　　【摘要】 目的：探讨川芎嗪对结扎冠状动脉前降支（LAD）损伤冠状动脉内皮及心肌的保护作用. 方法：将45只犬分为川芎嗪（TMP），维拉帕米（Ver）和对照组（Control ）3组，结扎LAD阻断血流75%，分别测定3组结扎前及结扎后不同时段的分泌型P选择素（sPselectin）、内皮素1（ET1）、一氧化氮（NO）及心肌肌钙蛋白T（CTnT）的含量变化，Western blotting法检测心肌组织Pselecntin基因表达情况. 结果：3组结扎后NO，ET1，sPselectin及CTnT的在不同时段含量变化组间差异有统计学意义（P<0.01）， Pselectin基因表达TMP组较低，Ver组和Control组有显著表达. 结论：川芎嗪可有效抑制结扎LAD后缺血再灌注对冠脉内皮细胞及心肌的损伤，减轻冠状动脉狭窄和心肌梗死的程度.

　　【关键词】 内皮细胞； 心肌保护； 川芎嗪； 冠状动脉狭窄

　　0引言

　　内皮细胞损伤是引起冠状动脉搭桥术后（coronary artery bypass graft, CABG）血管桥再狭窄的关键原因，CABG术内皮细胞和心肌保护一直没有显著突破［1］. 我们采用结扎犬冠状动脉前降支(left anterior decending coronary artery, LAD)方法，造成典型的局部冠状动脉狭窄和心梗模型，应用川芎嗪（ligustrazine or tetramethlpyrazine，TMP），与维拉帕米（Verapamil,Ver）及空白对照组进行对比，分析TMP对在体复杂生理状态下内皮和心肌损伤的抑制作用，探讨其对冠状动脉狭窄的可能防治作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　TMP纯度：99%，无锡第七制药有限公司；Ver，上海禾丰制药有限公司. 放免法测定内皮活性因子ET1试剂盒及硝酸还原酶法间接测定NO试剂盒由北京北免东雅生物技术研究所提供，分泌型P选择素(sPselectin)检测试剂盒及Western blotting试剂购自于Sigma Chemical Co.，快速一步法检测肌钙蛋白T(cardiac troponin T,CTnT)试剂盒购自美国Boehringer Mannheim公司；Viridia M3多功能监护仪（德国产）,CYAM32麻醉呼吸机，γ放免检测仪，ACUSON128XP/10彩色多普勒电脑显像仪（美国产，探头频率2.5~4.0 MHz）.

　　1.2方法

　　健康杂种犬45只，体质量（14.8±6.7）kg, 雌雄不限,由安徽医科大学实验动物中心提供，随机分成3组，TMP组、Ver组和Control组（空白对照组），每组各15只. 首次用3 g/L戊巴比妥钠30 mg/kg iv初步麻醉动物后，气管插管接CYAM32麻醉呼吸机予机械通气，给予室内空气混合氧及氟烷； Viridia M3多功能监护仪连续监测心电图、直接动脉压、中心静脉压，左侧第4肋间小切口进胸，打开心包，找到LAD，于LAD近端发出处约0.5 cm，用换瓣线带针穿过前降支深面，备结扎阻断；将ACUSON128XP/10彩色多普勒超声的消毒探头(2.5~4.0 MHz)直接置于备结扎处远断冠状动脉外心表，测量动脉的每分血流量［2］. 根据血流量测定阻断75%并打结固定. 分别于阻断前及阻断后5, 15, 30, 45和60 min经右心耳处抽血6 mL，备测NO, ET1水平，于阻断前及阻断后3和6 h分别自静脉置管抽血2 mL备测CTnT含量，及于阻断前及阻断后30 min，2，6，12和24 h备测Pselectin含量. 于结扎后2和12 h切取结扎后局部供血区心肌检测心肌组织Pselectin基因表达，并于结扎前切取正常心肌作为对比.

　　TPM组于结扎前20 min用10 mg/kg TMP注射液iv，手术后3 d连续注射TMP注射液10 mg/(kg・d)；Ver组于结扎前5 min用0.5 mg/kg Ver加入生理盐水溶液中iv，手术后3 d同样连续注射Ver 0.5 mg/(kg・d)；Control组采用0.9 g/L生理盐水20 mL iv. 严格按各试剂盒说明书处理保存的被测样品，按要求采用放免法测定ET1含量，硝酸还原酶法测定NO-2/NO-3水平，并出NO的含量，快速一步法检测CTnT含量，双抗体夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定sPselectin含量. 低温下提取心肌组织匀浆，缓冲剂(50 mmol/L Tris, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 g/L三硝基甲苯X100, 10 g/L苯基烷硫酰氟化物, 1 g/L亮肽素, 1 g/L抑肽酶)处理，孵育10 min， 组织匀浆离心(3000 r/min, 5 min, 4℃)，上清液于280℃贮存，样品(每格100 mg蛋白，bihionic acid assay)， 加入十二烷基钠硫酸聚丙烯纤胺凝胶中电泳(50 g/L堆胶, 75 g/L分离胶)， 将印迹从明胶电转移至硝酸纤维薄膜上，封闭后, 印迹加兔多克隆抗体孵育2 h，(1∶5000) 抗缩氨酸对应于25羧基端，Pselectin氨基酸(31)， 羊抗兔抗体与辣根过氧化酶共扼，加二抗，最后冲洗印迹，用ECL 化学荧光底物浸染，Xray胶片放射自显影观察.

　　统计学处理：  计量资料均以x±s表示，应用SAS软件，采用重复测量的方差分析，以分析组间和组内差异显著性.

　　2结果

　　2.1内皮活性因子含量的变化TPM组在结扎冠状动脉前降支后血浆NO和ET1检测含量变化与Ver及Control组对比差异有统计学意义，总模型有统计学意义(P<0.01), 测量时段间及测量时段与组别间交互作用有统计学意义(P<0.01，Fig 1, 2).

　　2.2心肌及血浆sPselectin变化结扎LAD后心肌Pselectin基因表达情况见Fig 3. TPM组在结扎冠状动脉前降支后各时段血浆sPselectin含量变化与Ver及Control组对比差异有统计学意义，总模型有统计学意义(P<0.01), 测量时段间及测量时段与组别间交互作用均有统计学意义(P<0.01，Fig 4).

　　2.3CTnT检测含量变化TPM组在结扎LAD后各时段检测含量变化与Ver及Control组对比差异有统计学意义，总模型具有统计学意义(P<0.01), 测量时段间及测量时段与组别间交互作用均有统计学意义(P<0.01，Fig 5).

　　3讨论

　　本实验结果显示，TMP可显著增加冠状动脉内NO含量，抑制ET1生成，与Ver组及Control组间差异有显著性，反映其对ET1表达具有有效的调控作用. TMP上调NO/ET1引起其他多种内皮因子的表达变化和一系列连锁改变， NO/ET1上调对减轻血管内膜增生和心肌损伤有重要作用. NO增加激活GC使cGMP增加，或直接作用于K+通道，如大电导的钙激的钾通道（BKca）而发挥强大的血管扩张作用［3］.  ET1表达增加并与特异受体结合抑制冠状动脉收缩及减轻末端分支血管阻力， 并通过抑制ET1对血管平滑肌细胞中的cmyc等原癌基因激活作用及对抑癌基因p53表达的抑制作用，而抑制平滑肌细胞增生和迁移，及成纤维细胞合成胶原，减轻内膜增厚［4］.
我们发现TMP可以显著抑制血浆中sPselectin增加，显著抑制心肌组织Pselectin基因表达，表明其对缺血再灌注损伤过程炎症的强烈抑制作用. Pselectin表达和细胞间释放对白细胞进入损伤组织起着关键作用，其表达水平反映炎症激活程度［5］. 另外，TMP抑制血小板产生血小板源性Pselectin，可以减轻缺血再灌注损伤的炎症反应和血栓形成，进而抑制炎症和细胞毒损伤对亚细胞致死性损伤连锁反应的放大作用，减少炎症引起的心脏功能衰竭的发生［6］. 结扎冠状动脉前降支后TPM组CTnT含量升高受到显著抑制，表明TMP可以减轻心肌梗死程度. 心肌中存在CTn，是高特异性和敏感性mAb检测指标，强调CTn作用及作为心肌缺血坏死指标目前已被广泛推崇［7］. CTn包括T,I,C，CTn联结原肌球蛋白，共同构成横纹肌的主要收缩单位，结扎LAD后造成局部心肌缺血，TMP通过其内皮细胞保护作用使冠状动脉扩张、微循环速度和血管开放数目增加，另外通过改变微血管内的血液流变学状态，而增加单位面积内开放的毛细血管数，以及抑制炎症作用和抑制自由基介导的组织损害作用，而缩小心肌梗死范围、减轻病变程度，具有显著的心肌保护作用. 我们认为TMP可以抑制结扎LAD导致的对局部动脉内皮及供血区心肌损伤，增加来自回旋支、对角支动脉以及右冠动脉远段分支部分侧枝循环扩张对缺血部位的再灌注，并减轻再灌注损伤，对冠状动脉内皮及心肌有显著的保护作用. 通过其对内皮表达功能的调控作用，TMP可有效防治冠状动脉狭窄及减轻心肌梗死程度，可能具有防治CABG术后血管桥再狭窄的作用.

　　【】

　　［1］ Herlitz J. Secondary prevention after coronary artery bypass graftingwhat do we know?［J］.  Scand Cardiovasc J,  2004； 38(2):69-74.

　　［2］ Krzanowski M, Bodzor W, Brzostek T, et al. Value of transthoracic echocardiography for the detection of highgrade coronary artery stenosis: Prospective evaluation in 50 consecutive patients scheduled for coronary angiography［J］.  J Am Soc Echocardiogr, 2000； 13(12):1091-1099.

　　［3］ Chin AS, Goldman LE, Eisenberg MJ. Functional testing after coronary artery bypass graft surgery: A metaanalysis［J］. Can J Cardiol, 2003；19(7):802-808.

　　［4］ Bousette N, Giaid A. Endothelin1 in atherosclerosis and other vasculopathies［J］. Can J Physiol Pharmacol, 2003；81(6):578-587.

　　［5］ Klvegren H, Majeed M, Bengtsson T. Chlamydia pneumoniae binds to platelets and triggers Pselectin expression and aggregation A causal role in cardiovascular disease?［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003；23(9):1677-1683.

　　［6］ Chello M, Mastroroberto P, Patti G, et al. Simvastatin attenuates leucocyteendothelial interactions after coronary revascularisation with cardiopulmonary bypass［J］.  Heart, 2003；89(5):538-543.

　　［7］ Giannitsis E, Katus HA. Comparison of  cardiac troponin T and troponin I assays―Implications of analytical and biochemical differences on clinical performance［J］. Clin Lab,  2004； 50(910): 521-528.