金雀异黄素对高糖培养下大鼠系膜细胞增殖及凋亡的影响

         作者：孙莉静，袁伟杰，张小瑛，梅小斌，郭志勇，陈光椿，张军

【关键词】  细胞凋亡

    Effect of genistein on apoptosis and proliferation of rat mesangial cells cultured in high glucose

　　【Abstract】 AIM: To evaluate the effect of different concentrations of genistein on the proliferation and apoptosis of rat mesangial cells cultured in vitro in high glucose. METHODS:  Mesangial cells were treated in different groups. Control group (low glucose 1 g/L without genistein) and experimental groups (high glucose 4.5 g/L with genistein 0, 1, 5, 10, 30 and 50  μmol/L) were established and incubated for 12, 24, 36 and 48 h. The proliferation effect of genistein on cells was measured by MTT method. Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from different groups, the terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique and flow cytometry using propidium iodide staining were performed to identify or quantify the apoptosis of cells. RESULTS:  Quantitative analysis of apoptotic cells showed that the apoptotic rate of the mesangial cells treated with genistein for 24 h was significantly higher, in 10, 30 and 50 μmol/L genistein groups than that in normal control group (P<0.05). No significant difference of the growth inhibition was found in 0, 1 and 5 μmol/L genistein groups. The cell apoptotic rate increased in a positive manner of genistein concentration and culture duration. CONCLUSION:  Genistein has an intrinsic capability of inhibiting the proliferation and inducing the apoptosis of mesangial cells in cultured high glucose and these effects are in a genistein concentration and time dependent manners.

　　【Keywords】 genistein；cell proliferation；apoptosis

　　【摘要】 目的：探讨金雀异黄素对体外高糖条件下大鼠系膜细胞（MC）增殖及凋亡的影响. 方法：对照组：低糖DMEM培养液（不含金雀异黄素），实验组：高糖DMEM培养液（含0，1,5，10，30，50 μmol/L金雀异黄素），各组分别培养12，24，36，48 h. 氮蓝四唑盐（MTT）法检测MC的增殖情况，DNA琼脂糖电泳、末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法、流式细胞术3种方法检测细胞凋亡情况. 结果：10，30，50 μmol/L金雀异黄素作用24 h可明显诱导细胞凋亡（P<0.05），而0，1，5 μmol/L作用不显著. 随着金雀异黄素浓度的增加，凋亡比例增加；同一浓度的金雀异黄素随着作用时间的延长，凋亡比例亦增加. 结论：一定浓度的金雀异黄素在体外高糖培养条件下，可抑制大鼠MC增殖，促进其凋亡，且与其浓度和作用时间有关.

　　【关键词】 金雀异黄素；细胞增殖；细胞凋亡

　　0引言

　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见和严重的并发症之一，是造成终末期肾衰的主要病因，具体发病机制目前尚不清楚. 近年发现大豆及大豆蛋白具有加速脂质清除、抗动脉粥样硬化、抗氧化等生物功效［1］，这些作用与其中所含的多酚类混合物－大豆异黄酮密切相关. 肾脏血管病变、高脂血症和氧自由基等是DN发生和的重要因素，大豆异黄酮的上述功能，暗示了它们可能对肾脏细胞具有良好的保护作用［2］. 目前此类物质对肾脏细胞直接影响的报道较少. 肾脏系膜细胞（mesangial cell, MC）是致病因子作用的主要靶细胞. 我们研究大豆异黄酮的主要生理活性成分―金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC生长的影响如下.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　大鼠MC株38℃水浴复苏，生长于含60 mL/L胎牛血清的低糖DMEM培养液中，7 d左右达融合状态，实验采用传代的第3代MC，进入实验后无血清（5 mL/L）培养，分别在金雀异黄素作用的12，24，36和48 h终止培养. 实验分为对照组：低糖无血清DMEM培养液（葡萄糖浓度1 g/L不含金雀异黄素）;实验组：高糖无血清DMEM培养液（葡萄糖浓度4.5 g/L金雀异黄素浓度为０，1，5，10，30和50 μmol/L），空白对照组只加培养液无细胞. Genistein购自Sigma公司（Mr 270.2，纯度≥98%），取Genistein 5 mg溶于1.85 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配成1×10-2 mol/L母液，实验时按需要稀释成各浓度工作液. 细胞凋亡检测试剂盒购自宝灵曼公司，细胞周期检测试剂盒购自BectonDickinson公司，噻唑蓝(MTT)购自上海华舜生物试剂公司.

　　1．2方法

　　1．2．1MTT法检测细胞增殖MC生长于96孔培养板（1×104／孔），24 h后换不同浓度金雀异黄素的无血清培养液，培养结束后每孔加入MTT液20 μL，37℃，50 mL/L CO2继续培养4 h，反应结束后每孔再加入DMSO 150 μL，振荡至蓝紫色结晶完全溶解. 将溶解后的液体转至96孔酶标板，在A490 nm处以空白对照组调零，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度（A）值. 每组设4个复孔.

　　1．2．2DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡MC生长于6孔板（3×105／孔），培养结束后2.5 g/L胰酶消化，收集各组飘浮的细胞和用胰酶消化的细胞，3000 r/min常温离心6 min，加入0.5 mL DNA裂解液，37℃ 50 mL/L CO2培养30 min. 加20 g/L蛋白酶K 5 μL，55℃水浴过夜. 等体积酚、酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，２倍体积的无水乙醇沉淀DNA，5000 g低温离心15 min，750 mL/L乙醇洗2遍，晾干，加入pH 8.0的TE 400 μL摇匀，再加入10 g/L RNaseA 5 μL, 37℃ 50 mL/L CO2培养30 min. 酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，２倍体积的无水乙醇沉淀DNA，5000 g低温离心15 min，750 mL/L乙醇洗2遍，自然晾干，加入TE 20 μL溶解，4℃保存. 琼脂糖电泳检测DNA纯度. 10 μL DNA溶液与4×上样缓冲液2 μL混匀后，于15 g/L琼脂糖凝胶100 V电压下电泳，紫外灯下观察并摄影.

　　1．2．3TUNEL末端标记法检测细胞凋亡MC生长于含消毒盖玻片的6孔板（3×105／孔），终止培养后按以下流程处理细胞：40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，PBS冲洗盖玻片，2 mg/L蛋白酶K消化细胞，于37℃， 50 mL/L CO2培养20 min，PBS冲洗盖玻片，加入100 μL TUNEL缓冲液，37℃，50 mL/L CO2培养60 min，冲洗盖玻片，加入TUNEL标志物，37℃，50 mL/L CO2培养30 min，冲洗盖玻片，DAB显色10 min，蒸馏水冲洗，苏木素衬染，自来水返蓝，冷风吹干，明胶封固，60℃烤箱烤干. 显微镜下观察并照相，阳性标记细胞核为棕染棕黄色颗粒.

　　1．2．4流式细胞仪检测细胞凋亡MC生长于6孔板（3×105／孔），培养结束后2.5 g/L胰酶消化细胞，收集各组飘浮的细胞和用胰酶消化的细胞，3000 r/min常温离心5 min，弃上清，按细胞周期试剂盒说明书操作：加入Buffer缓冲液1 mL，3000 r/min常温离心5 min，弃上清，加入Buffer缓冲液1 mL，3000 r/min常温离心5 min，弃上清. 加入Solution A 250 μL，摇匀，室温放置10 min；加入Solution B 100 μL，室温放置10 min；最后加入Solution C 100 μL，4℃放置10 min，上机检测细胞周期及凋亡率. 每个实验重复３次. 以CellQest软件分析细胞周期及凋亡率.

　　统计学处理：计量资料用x±s表示，组间差异比较采用方差分析，两两比较用Dunnettt检验，使用SPSS 10.0软件进行统计分析，P<0.05时认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2．1MTT法检测细胞增殖在高糖培养的早期（48 h以内），高糖可促进MC的增殖（与对照组相比P<0.05）. 低浓度金雀异黄素（1 μmol/L）对细胞生长的抑制作用不显著；高浓度的金雀异黄素（>5 μmol/L）对细胞的抑制作用较强，作用具有时间、剂量依赖效应(Tab 1).表1金雀异黄素作用下大鼠系膜细胞增殖状况（略）

　　2．2DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡高浓度组10，30，50 μmol/L组作用24 h，DNA琼脂糖凝胶电泳出现特征性的由大小不同的DNA片段组成的数条梯形条带（DNA ladder）；5 μmol/L组出现模糊不清的条带；0 μmol/L组、1 μmol/L组与对照组在离加样孔不远处，为大分子基因组DNA条带表现，无梯形条带出现，意味着几乎没有细胞凋亡的发生(Fig 1).

　　2．3TUNEL末端标记法检测细胞凋亡金雀异黄素浓度为10，30，50 μmol/L组作用24 h，细胞核呈现数量较多的棕染棕黄色颗粒，0，1 μmol/L组和对照组基本无棕染棕黄色颗粒出现，而5 μmol/L组有少量出现（Fig 2）.

　　2．4流式细胞仪检测细胞凋亡金雀异黄素作用于同一时间，实验组（10，30，50 μmol/L）MC的凋亡率明显高于对照组，5 μmol/L组的凋亡率略高于对照组，而0，1 μmol/L与对照组相比无明显差异（Fig 3）.同一浓度10 μmol/L金雀异黄素随着作用时间的延长，凋亡率亦增加.

　　3讨论

　　体外葡萄糖1 g/L升至4.5 g/L时对MC具有双重作用, 培养24~48 h内可刺激细胞增殖，72~96 h则抑制细胞增殖，促使细胞发生肥大. 我们将4.5 g/L葡萄糖作用于MC，在48 h内可促进MC增殖.细胞的凋亡与增殖平衡是组织保持一定的细胞数量，维持正常生理功能的主要因素［3］. 许多研究表明,细胞凋亡是使增殖的肾小球MC数量和结构恢复正常的重要机制［4］. 在DN的过程中，有效地阻止早期MC过度增殖及细胞外基质（ECM）的聚积，是防止肾小球硬化的理想措施. 金雀异黄素是一种天然异黄酮类物质，具有雌激素活性作用［5］，同时具有抗氧化、抗炎和抗增生等特性，是酪氨酸激酶（PTK）［6］、DNA拓朴异构酶Ⅱ和核糖体S6激酶的抑制剂，能调控细胞周期的有丝分裂、细胞生存、细胞转化和诱导细胞分化. 我们发现,在48 h内，1 μmol/L金雀异黄素对细胞增殖影响不显著；高浓度的金雀异黄素（>5 μmol/L）对细胞增殖具有显著的抑制作用，作用具有时间依赖、剂量依赖关系. 如果金雀异黄素促进DN早期增殖的MC凋亡能得到进一步确证，则有可能起到延缓早期病情进展的作用.

　　【】

　　［1］ Anthony MS. Soy and cardiovascular disease: Cholesterol lowering and beyond［J］. J Nutr, 2000;130(3):662-663.

　　［2］ Velasquez MT, Bhathena SJ. Dietary phytoestrogens: A possible role in renal disease protection［J］. Am J Kidney Dis, 2001;37(5):1056-1068.

　　［3］ Roos A,Sato T,Maier H,et al. Induction of renal cell apoptosis by antibodies and complement［J］. Exp Nephrol, 2001;9:65-70.

　　［4］ Amore A, Coppo R. Role of apoptosis in pathogenesis and progression of renal disease［J］. Nephron, 2000;86:99-104.

　　［5］ An J, Tzagarakis C,Scharschmidt TC, et al. Estrogen receptor betaselective transcriptional activity and recruitment of coregulators by phytoestrogens［J］. J Biol Chem, 2001; 276(21): 17808-17814.

　　［6］ Wijetunge S,Lymn JS,Hughes AD. Effects of protein tyrosine kinase inhibitors on voltageoperated calcium channel currents in vascular smooth muscle cells and pp60(csrc) kinase activity［J］. Br J Pharmacol, 2000; 129(7): 1347-1354.