新的肾上腺脑白质营养不良基因突变1例的鉴定
【关键词】 肾上腺白质营养不良
Identification of a novel mutation in the ALD gene of a Chinese patient with adrenoleukodystrophy
【Abstract】 AIM: To identify the mutational genotype in a Chinese family with adrenoleukodystrophy (ALD). METHODS: Total RNA was isolated from the peripheral blood of the patient and ALD mRNA was amplified by long RTPCR. The PCR products were subjected to direct sequencing with ABIs BigDye kit on type 377 sequencer. A 330 bp fragment spanning the mutation was amplified from the genomic DNA of the patient and his family members and digested with the restriction enzyme BspLI. RESULTS: C was changed to T at base 1523, replacing the proline at codon 508 with leucine. The mutation was inherited from his mother, which was heterozygous for the mutation. His father and sister were free from this mutation. CONCLUSION: A novel mutation, the P508L mutation, is found in the ALD gene of a Chinese patient with ALD.
【Keywords】 adrenoleukodystrophy; ALD gene; mutation, missense; ALD protein
【摘要】 目的： 对1例肾上腺脑白质营养不良（ALD）患者及其家系成员的ALD基因的突变类型进行鉴定. 方法： 以外周血RNA为模板，采用长链RTPCR技术，分4个片段扩增ALD基因mRNA的编码序列，对4个PCR产物进行直接测序，筛查整个基因编码区. 通过限制性内切酶酶切分析患者及其家系成员基因组ALD基因片段，以进一步确证所发现的基因突变. 结果： 位于患者ALD基因第6外显子的第508位密码子存在一个新的错义突变CCC→CTC (P508L)，患者母亲为突变携带者，患者父亲和妹妹不存在此突变. 结论： 发现ALD患者一个新的ALD基因突变，即P508L突变.
【关键词】 肾上腺白质营养不良；ALD基因；突变，误义；ALD蛋白
0引言
肾上腺脑白质营养不良(ALD, adrenoleukodystrophy)是最常见的一种遗传性中枢神经髓鞘合成病变［1］. 致病基因（ALD基因）位于X染色体，编码一个有745个氨基酸残基的过氧化物酶体膜蛋白，即ALD蛋白（ALD protein, ALDP）. 我们对1例肾上腺脑白质营养不良患儿及其家庭成员的ALD基因突变进行了分析.
1对象和方法
1．1对象男，7岁，汉族，福建省周宁县人，因进行性视力下降、步态不稳1 a余入院. 检查：神志清楚，对答尚切题，言语含糊，不配合，双眼视力光感，吞咽困难，饮水呛咳. 心、肺、肝、脾未见异常. 脑电图中度异常，体感诱发电位异常. 颅脑MRI示枕顶部蝶形长T1和长T2信号的病灶. 气相色谱查患者血浆24碳饱和脂肪酸（C24∶0）浓度：13.48 mg・L-1, 22碳饱和脂肪酸（C22∶0）浓度：9.05 mg・L-1，两个浓度比（C24∶0/C22∶0）等于1.49(正常范围0.939左右). 患者非近亲婚配所生，另有一妹妹，无家族史. 临床诊断：肾上腺脑白质营养不良（儿童脑型）.
1．2方法ALD基因的mRNA长3.7 kb，其中编码区为2238 bp. 本研究合成4对引物［2］，即：PIF和RT1, PⅡF和RT2, PⅢF和RT3, PⅣF和RT4，分4段（自5′端依次为ALD1, ALD2, ALD3, ALD4）对ALD基因编码区进行扩增，预期大小分别是722, 700, 723和646 bp，其中ALD1的3′端和ALD2的5′端部分重叠，ALD2的3′端和ALD3的5′端部分重叠，ALD3的3′端和ALD4的5′端部分重叠. 若以PIF和RT4为引物对扩增ALD基因cDNA， 预期片段大小是2440 bp. 引物委托上海生工（Sangon）生物工程公司合成.
1．2．1长链RTPCR及测序从患者取新鲜抗凝血1.5~3 mL，按Qiagen产品（RNeasy Mini Kit）说明书提取总RNA. 长链RTPCR按TaKaRa试剂盒（RNA LA PCRTM Kit）说明书进行. 先进行反转录，然后在PE2400型热循环仪上进行PCR反应：94℃变性2 min后，按94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min循环30次. 最后一个循环结束后继续在72℃延伸8 min. 将上述PCR混合物10~20 μL上样于15 g・L-1的琼脂糖凝胶电泳，切下含预期片段（2440 bp）的胶块，利用Qiagen的DNA凝胶回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction kit）从胶块中回收DNA. 以此DNA为模板，组配4个2次PCR反应：反应体积50 μL，含模板1 ng, 引物各25 pmol, 4种dNTP各0.2 mmol・L-1, Taq酶（BioAsia）2.5 U, MgCl2 1.5 mmol・L-1，分别扩增ALD1, ALD2, ALD3, ALD4，扩增条件统一为：94℃预变性2 min后，按94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s进行10~15个循环，最后一个循环结束后继续在72℃延伸9 min. 用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit）直接从PCR混合液中纯化PCR产物. 将纯化的4个片段连同相应PCR引物，寄上海博亚生物技术有限公司进行序列测定.
1．2．2基因组DNA片段扩增和限制性内切酶分析患者及其家庭成员的外周血基因组DNA使用Qiagen的DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）提取. 根据突变所在部位，用Omiga 2.0软件设计针对外显子6全长序列的PCR引物，上游引物(PA5F)序列为：5′CTGCGCTCTCTGGCGTCA3′，下游引物（PA5R）序列为：5′CACAGCCCGTCTCTGGCT3′，预期扩增片段长330 bp. 扩增条件：95℃预变性4 min后，按94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s进行30个循环. 用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit）从PCR混合液中纯化PCR产物. 根据突变的性质，用限制性内切酶BspLI（MBI Fermentas）对纯化的PCR产物进行酶切, 于100 g・L-1聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 溴化乙啶染色后用美国BioRad公司的FluorS型凝胶成像仪采集电泳结果.
2结果
2．1ALD基因mRNA的RTPCR扩增及测序用长链RTPCR试剂盒对患者外周血ALD基因mRNA的整个编码区进行扩增，可获得预期的扩增片段（2440 bp），也可见一些非特异性片段. 为提高特异性，并获得足够的PCR产物，先从凝胶中回收上述覆盖整个编码区的扩增产物，然后分4段（ALD1, ALD2, ALD3, ALD4）进行第2轮PCR反应. 2次PCR产物的琼脂糖凝胶（15 g・L-1）电泳结果(Fig 1)，14依次是ALD4, ALD3, ALD2和ALD1，4个片段均获得特异性扩增，其大小与预期完全相符. 直接用Qiagen试剂盒从2次PCR混合物中纯化ALD1, ALD2, ALD3, ALD4 4个片段后，用美国ABI公司的BigDye系统（在377型测序仪上）分别对其进行序列测定. 正常对照(Fig 2A)和患者(Fig 2B)ALD3片段部分序列， 序列下划线处示发生突变的密码子部位. 结果显示，患者ALD基因mRNA仅有一个碱基发生改变（1523C→T），即第508个密码子（位于ALD3片段上）发生了CCC→CTC的改变，使正常的脯氨酸被亮氨酸替换. 正、反向测序结果一致.
图1-图2 (略)
2．2限制性内切酶分析以患者及其家庭成员的基因组DNA为模板，扩增突变所在的ALD基因第6外显子，扩增片段330 bp. 正常情况下，该片段内含有2个BspLI酶切位点（GGN↓NCC），酶切后产生72, 34和224 bp 3个片段. 患者第508密码子的CCC→CTC突变导致72与34 bp片段之间的酶切位点消失，酶切结果产生106和224 bp 2个片段. 酶切后的电泳结果(Fig 3)，可以看出：患者父亲和妹妹的酶切模式为正常人模式（含72, 34和224 bp 3个片段），患者的酶切模式与预期相符（含106和224 bp两个片段），患者母亲的酶切图谱中既有106和224 bp两个片段，也有72和34 bp两个片段，为杂合子（携带者）. 以上结果还经过对330 bp片段的直接序列测定证实.
图3患者及其家庭成员ALD基因外显子6扩增产物的酶切分析 (略)
3讨论
本患者6岁起病，以进行性视力下降等中枢神经系统症状为主，病程进展迅速（1 a内成双目失明），头部MRI查出典型的大脑顶枕部长T1和长T2信号病灶，血浆极长链饱和脂肪酸浓度升高（C24∶0/C22∶0比值超出范围），符合儿童大脑型ALD的临床诊断［1］.
ALD表现出高度的遗传异质性. 根据有关国际权威数据库（ald.nl）统计，目前在全球ALD患者中已鉴定出500多个ALD基因突变（其中有一部分未发表，仅在互联网上公布）， 其中有一半以上仅见于单一家系. 本病在临床表现方面（表现型）也是高度异质的，同一家族的不同患者在起病时间和临床症状上也往往不尽相同［3］. 表现型的异质性说明开展临床基因诊断的必要性，但遗传的高度异质性又使临床基因诊断的开展面临较大困难.我们曾报道在ALD患者发现的第1个基因突变［2,4］，本例P508L突变是在中国人群发现的第2个ALD基因突变. 查阅国内外，尚未见有关此突变的报道. 以下几点支持该突变是病理性突变的观点：① 患者的ALD基因的整个编码区只存在一个碱基改变（1523C→T），其余部分与正常对照的序列和GenBank参考序列（NM000033）一致；② 患者父亲和妹妹的ALD基因不存在该突变，其母亲为携带者，与ALD作为X染色体隐性遗传病的特点符合；③ 突变使ALDP的第508位氨基酸由Pro变成另一个与之性质差别较大的Leu；④ 突变所改变的氨基酸位于ALDP功能区ATP结合区保守序列内［5］；⑤ 1999年Takano等曾报道在紧邻的第507位氨基酸发生的一个突变，即G507V［3］. 该突变具体如何影响ALDP的结构和功能，有待进一步研究.
以往ALD基因的突变分析在技术上大多采用常规RTPCR方法：先合成cDNA，然后分段对cDNA进行扩增［6］. 我们将新开发的长链RTPCR技术引入ALD基因的突变分析中：先扩增ALD基因mRNA编码区全长，然后分段进行2次PCR扩增. 该技术途径简化了操作，提高了重复性，减少了引物数. 该技术途径在本研究的成功应用，将为今后其他患者的基因诊断带来便利.
【参考文献】
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