兔卵母细胞的超数排卵与孤雌激活

          作者：王春雨，鲁进，武浩，魏欣，赵甫涛，贾战生

【关键词】  卵母细胞

    Superovulation and parthenogenetic activation in rabbits

　　【Abstract】 AIM: To explore optimal superovulating methods and parthenogenetic activation conditions in rabbits. METHODS:  Virginal and multiparous rabbits were superovulated by folliclestimulating hormone (FSH) at different concentrations. After being obtained, the mature oocytes were activated by electric current with different strength. RESULTS:  There were significant differences in the ovulating total numbers between hormone groups and control group (P<0.05) and between the group with FSH 15 U and the other hormone groups ［(15.00±1.58) vs (31.83±3.06), (31.80±3.27), P<0.05］. So was the difference between virginal rabbits and the multiparous rabbits. The rates of merogenesis （85.59％） and the rates of development to 4-8 cell stage（21.19％） of rabbit oocytes were the highest in the group with 200 V/mm direct current pulses treatment among the four groups. CONCLUSION:  The superovulation efficiency in rabbits with FSH (25 U) or FSH (80 U) + PVP treatment is optimized and the superovulation efficiency is better in multiparous rabbits than that in virginal rabbits. The comparatively suitable oocyte activation condition is that of 200 V/mm, 40 μs and 2 times of direct current pulses with a 1 s of interval.

　　【Keywords】 oocytes; parthenogenetic activation; rabbit

　　【摘要】 目的：探索兔卵母细胞的最佳超排方法及孤雌激活的条件，为人兔异种核移植提供充足的兔卵母细胞. 方法：采用不同剂量的垂体促卵泡素（FSH）对青年兔和经产兔进行超数排卵，获得兔卵母细胞后，以不同强度的直流电脉冲对兔卵母细胞进行孤雌激活. 结果：在排卵总数方面，3个激素组均高于对照组（P＜0.05），且FSH 25 U激素组（31.80±3.27）与FSH 80 U+聚乙烯吡咯酮(PVP)激素组（31.83±3.06）均高于FSH 15 U激素组（15.00±1.58），经产兔优于青年兔（P<0.05）；在200 V/mm组孤雌激活兔卵母细胞的卵裂率（85.59％）和4~8细胞期发育率（21.19％）最高，与240 V/mm组（71.43%, 10.48%）之间存在统计学差异（P＜0.05）. 结论：FSH 25 U及FSH 80 U+PVP方案均能产生最佳超排效果，经产兔优于青年兔；电场强度200 V/mm，脉宽40 μs，2次脉冲、间隔1 s为兔成熟卵母细胞的较理想的激活条件.

　　【关键词】 卵母细胞；孤雌激活；兔

　　0引言

　　性克隆（therapeutic cloning）是体细胞核移植技术和胚胎干细胞技术相结合的产物，将成为人类医疗史上革命性的技术. 由于人类卵母细胞来源非常有限，且受到、伦理等多种因素的限制，很难获得足够数量的人卵母细胞用于实验研究. 异种核移植技术的出现为解决这一难题提供了可能. 实践证实，家兔卵母细胞可以作为异种核移植研究的理想受体，可支持人类体细胞去分化并发育至囊胚期［1］. 我们在以往研究工作的基础上, 利用本地白兔进一步探讨了不同超数排卵处理方法以及不同年龄阶段白兔的超排效果. 目的在于筛选一种效果好、成本低的家兔超排方案，为人兔异种细胞核移植的研究提供充足的成熟兔卵母细胞. 此外，我们还采用不同强度直流电脉冲对超排获得的成熟兔卵母细胞进行孤雌激活的研究，探索最佳的激活条件，为下一步获得人兔核移植胚胎干细胞，并向肝细胞诱导分化做准备.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　①实验动物：体质量2.5~3.5 kg，6~18 mo龄性成熟雌性本地白兔42（经产兔20只，青年兔22）只，购自第四军医大学实验动物中心. ②主要试剂和器械: 兽用垂体促卵泡素(FSH)及注射用人绒毛膜促性腺素(hCG)，购自宁波激素二厂; PBS缓冲液（自配）;胎牛血清（四季青公司）;透明质酸酶、聚乙烯吡咯酮（PVP）（Sigma）; DMEM, RPMI 1640(Gibco);电融合液（自配）;解剖显微镜（Olympas）;电融合仪（Model ECM 830, BTX, San Diego）;外科手术器械.

　　1.2方法

　　1.2.1超数排卵处理将实验兔随机分为4组分笼饲养，每笼3只，喂以相同的颗粒饲料,自由饮水. 实验前15 d，选择5只8 mo龄健康雄兔进行输精管结扎手术. 1组11 （经产兔5 ，青年兔6） 只. 受试兔经皮下注射FSH，2次/d，15 U/次，连续3 d，最后一次注射FSH 后12 h，由耳缘静脉注射hCG 100 U; 2组10（经产兔5 ，青年兔5） 只. 受试兔经皮下注射FSH，2 次/d，25 U/次，连续3 d，最后一次注射FSH 后12 h，由耳缘静脉注射hCG 100 U; 3组11（经产兔6，青年兔5）只. 朱华萍等［2］的实验方法，皮下一次性注射FSH 80 U与250 g/L PVP的混合液，3 d后由耳缘静脉注射hCG 100 U. 对照组10 （经产兔4，青年兔6）只. 均为正常排卵的雌兔，取卵前14~16 h与结扎的雄兔1∶1合笼.

　　1.2.2卵母细胞的回收卵母细胞的回收方法参照廉颖等［3］方法进行. 注射hCG后，将试验兔与结扎的雄兔1∶1合笼，15 h后处死，剪下输卵管，抽取2～3 mL冲卵液（PBS+100 mL/L胎牛血清+100 u/mL青霉素+100 mg/L链霉素），由输卵管子宫端向输卵管伞端冲出卵丘卵母细胞复合体；置于1 g/L透明质酸酶中消化，并吹打去除卵丘细胞；在RD(RPMI 1640∶DMEM低糖=1∶1)培养液中冲洗3遍以上，进行卵母细胞计数.

　　1.2.3卵母细胞的孤雌激活筛选形态正常、透明带完整、第一极体明显的成熟卵母细胞用于电激活. 将欲激活的卵母细胞在电融合液（含有0.3 mol/L甘露醇、0.1 mmol/L MgCl2，0.05 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L HEPES, 0.5 g/L BSA）中平衡5 min，移入融合槽内，施以40 μs, 2次脉冲、间隔1 s，一定电场强度（160~240 V/mm）的直流电激活卵母细胞［1，4］. 激活操作后的卵母细胞置于RD培养液微滴内，在38.5℃，50 mL/L CO2培养箱中培养，每日观察，统计胚胎卵裂率和发育率.

　　统计学处理：实验所得数据应用SPSS 11.0软件进行处理，采用方差分析探讨不同激素剂量和兔龄对超数排卵的效果，采用χ2检验探讨不同电脉冲强度对卵母细胞激活及孤雌胚体外发育的影响. 均数用x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1不同剂量FSH超数排卵效果的比较在排卵总数上，3个不同剂量FSH 处理组均优于对照组(P<0.05），FSH 25 U激素组与FSH 80 U+PVP激素组之间无统计学差异，且均优于FSH 15 U激素组（P＜0.05）. 在可用卵数上，FSH 25 U激素组与FSH 80 U+PVP激素组之间无统计学差异，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）. 在FSH剂量相同的各实验组内，经产兔的排卵总数均高于青年兔，差异有统计学意义（P<0.05, Tab 1）.表1超数排卵效果及卵母细胞回收情况（略）

　　2.2电脉冲强度对兔成熟卵母细胞孤雌激活的影响如Tab 2所示，卵裂率和4~8细胞期发育率在200 V/mm组最高，其中200 V/mm组与240 V/mm组之间存在统计学差异（P＜0.05）. 其他各组之间虽然没有统计学差异，但从表中数据变化趋势看，随脉冲强度的增加，卵裂率上升，到200 V/mm后，如果进一步提高脉冲强度，则卵裂率反而下降，裂解率则随脉冲强度的增加而上升. 可见，过高的脉冲强度不利于卵母细胞的激活，反而对卵母细胞造成不可逆损伤. 因此，电场强度200 V/mm，脉宽40 μs，2次脉冲、间隔1 s为兔成熟卵母细胞的较理想激活条件.表2脉冲强度对家兔卵母细胞激活及孤雌发育的影响（略）

　　3讨论

　　目前，用于家兔超数排卵的激素组合，主要是FSH+hCG和PMSG+hCG，在激素的使用剂量方面，不同实验差别较大，所获结果也不尽相同. 刘亚等［5］研究发现，FSH+hCG方案优于PMSG+hCG，故我们采用FSH+hCG方案进行家兔超数排卵. 实验结果显示，FSH 25 U组及FSH 80 U+PVP组的超排效果明显优于FSH 15 U组及对照组. 可能是由于超排剂量过低时, 不足以引起较多卵泡成熟所致. 对经产兔和青年兔的超排处理显示，兔龄对超排效果的影响十分明显，激素组内经产兔排卵数显著高于青年兔,这与以往的研究结论一致［6,7］. 至于青年兔超排效果低于经产兔的原因尚不完全清楚,可能与青年母兔生殖机能发育不完善, 卵巢上的生长卵泡较少,发育不好所致；也可能是所采用的方案不适合青年母兔.

　　在使用FSH进行超排时，由于其半衰期短，仅为2~5 h，需分次连续注射，应用较为烦琐. PVP为一种大分子化合物，对FSH具有包被和缓释的作用，将FSH溶解于PVP中，可延长其在动物体内的半衰期，减少注射次数，应用较为简便. 从本实验结果可以看出，FSH 80 U+250 g/L PVP组与FSH 25 U组的排卵总数和可用卵数无统计学差异，而高于FSH 15 U组及对照组（P＜0.05）. 所以，完全可以将PVP应用于家兔的超数排卵.

　　作为卵母细胞激活的中间调节物，细胞内游离Ca2+浓度变化在卵母细胞受精激活及人工活化过程中起重要作用［8］. 电脉冲刺激可使细胞膜上产生可逆的微孔，细胞外Ca2+内流，使胞质内Ca2+浓度升高，从而激活卵母细胞. 电脉冲引起的微孔大小与脉冲强度、时间、溶液中Ca2+浓度有关. 研究表明，卵母细胞在施以多次电脉冲时可模仿其受精时的Ca2+波动，从而显著提高卵母细胞的激活率和激活后的发育. 电脉冲强度过大，则造成微孔不可逆，细胞受到损伤导致激活率下降［9］. 从本实验中可以看出，脉冲强度较低时，卵母细胞激活率低，脉冲强度过高，则造成卵母细胞不可逆损伤，激活率与孤雌胚的发育率都将下降. 卵母细胞的激活是细胞核移植的关键技术环节之一，卵母细胞激活和孤雌发育与细胞核移植成功密切相关，因为移核后的卵母细胞的核物质被供体细胞核所代替，移入的核物质的复制等过程完全依赖于卵母细胞的激活，因此卵母细胞激活和孤雌胚发育的研究对于提高细胞核移植的成功率也具有重要的意义和价值.

　　【】

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