表阿霉素和阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡

         作者：马祖胜 ，冯英明 ，姬统理 ，张贺龙 ，唐敏章，王文亮 ，郭双平

【关键词】  肝肿瘤

　　关键词: 肝肿瘤;细胞凋亡;表阿霉素;阿霉素

　　摘 要:目的  观察和比较表阿霉素和阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的作用，为临床肝癌的药物选择提供依据. 方法  用20μmol L-1 表阿霉素和阿霉素分别作用于人肝癌细胞株HCC-9204细胞3h，换液继续培养8h.用细胞形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪判定细胞凋亡情况. 结果  表阿霉素和阿霉素分别作用于HCC-9204细胞11h后，细胞形态学改变均符合凋亡细胞特征.凋亡细胞分别占细胞总数的13.8%和13.1%.MTT试验示各实验组与空白对照组间比较相差显著，表阿霉素和阿霉素相同剂量处理组之间比较无显著差异.细胞周期检测表阿霉素组G1 期、G2 期和S期分别为56.4%，10.4%和38.2%，阿霉素组分别为61.1%，8.6%和30.3%，对照组为31.1%，61.9%和6.0%. 结论  表阿霉素和阿霉素均能有效地诱导人肝癌细胞株HCC-9204细胞发生凋亡，无明显差异.
    
　　Epirubicin and doxorubicin induced apoptosis of hu┐man hepatic cancer cells
        
　　Abstract:AIM To provide the possibility for choice of drugs in clinical therapy of hepatic cancer，we observed and compared the effects of epirubicin and doxorubicin on induc-ing apoptosis in hepatic cancer cells.METHODS Human hepatic cancer cell strain were cultured with epirubicin（20μmol L-1 ）and doxorubicin（20μmol L-1 ）for3h respec-tively.Then the medium was replaced with a fresh one，and the cells were continuously cultured for8h.The apoptosis were identified and analyzed by cyto-morphology，DNA elec-trophoresis and flowcytometry.RESULTS MTT assay indi-cated a significant difference between the experimental groups and the blank control group.The percentage of apoptotic cell was13.8%in epirubincin group，and13.1%in doxorubicin.No significant difference was observed between the groups treated with equal concentrations of the two drugs.Morpho-logical changes in HCC-9204cell，which was observed after11h continuous culture with the two drugs indicated following apoptotic traits:①DNA electrophoresis showed ladder pat-terned bands;②Flowcytometry identified peaks typical of apoptosis.Cells in G1 ，G2 and S phase of cell cycle were56.4%，10.4%and33.2%in epirubincin group，and61.1%，8.6%and30.3%in doxorubicin group，and31.1%，61.9%，6.0%in control group，respectively.CON┐CLUSION The apoptosis can be induced effectively by both epirubicin and doxorubicin in HCC-9204cell，that shows lit-tle significant difference in DNA electrophoresis，flowcytom-etry and the morphological obscervation.
    
　　0 引言
    
　　细胞凋亡（apoptosis），是受基因调控、细胞主动参与其自身有一定程序的生理性死亡过程，又称为程序性细胞死亡或细胞自杀［1］ .已知许多化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡达到清除肿瘤的目的［2，3］ ，表阿霉素和阿霉素是治疗肝癌的常用药物，为比较表阿霉素和阿霉素对肝癌细胞凋亡的诱导作用，我们应用表阿霉素和阿霉素对培养的人肝癌细胞株进行诱导其发生凋亡的研究，探讨表阿霉素和阿霉素对肝癌细胞诱导凋亡的机制，为临床治疗肝癌的药物选择提供依据.

　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料 

　　表阿霉素由法码西亚-普强公司提供;阿霉素购于深圳万乐公司;MTT，RNase A和蛋白酶K购于Sigma公司;PCD-AKP标记盒购于Boehringer Mannheim公司;人肝癌细胞株HCC-9204由本校基础部病教研室提供.
 
　　1.2 方法 

　　将培养的HCC-9204肝癌细胞制成单细胞悬液，以每孔104 个细胞接种于进口96孔培养板中，每孔体积200μL，CO2 孵箱中培养2～3d，倒置显微镜下观察，待每孔细胞生长至对数生长期时，4℃放置1h，分别加不同浓度的表阿霉素和阿霉素.每6孔为一组，浓度相同.实验组分别为表阿霉素组和阿霉素组，剂量分为40，20，10和5μmol L-1 .对照组为未加药物的空白对照.实验组加药培养3h，移去药液，洗净药液后换培养液继续培养6h，每孔加新鲜配制的MTT（5g L-1 ）20μL作用4h，出现蓝色结晶，加二甲基亚砜150μL，振荡10min.比色用酶联免疫检测仪于490nm波长测定吸光度值，每组6个孔取均值，标准差，用方差分析进行统计学处理，比较各组间是否相差显著.待HCC-9204肝癌细胞生长至对数生长期，放置4℃1h，使细胞生长同步化，根据上述MTT试验结果，分别用4mL含20μmol L-1 表阿霉素、阿霉素的培养液作用3h，移去药液换培养液继续培养8h，倒置显微镜观察HCC-9204肝癌细胞约凋亡1/2～1/3，终止培养.收集已处理的培养瓶中细胞（1×107 ），酚-氯仿法提取DNA，用1.8g L-1 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察DNA电泳结果.
    
　　1.2.1 流式细胞仪检测 

　　收集各组肝癌细胞，制备单细胞悬液，乙醇固定，4℃过夜，生理盐水洗涤，离心2次，100μL约1×106 个单细胞悬液中加碘化丙啶染色液300μL作用15min，EPICS ProfileⅡ型流式细胞仪检测，观察各组是否存在凋亡细胞并测定其含量、各细胞周期所占百分比，设未处理的肝癌细胞为空白对照.
    
　　1.2.2 TUNEL检测细胞凋亡 

　　培养的HCC-9204肝癌细胞盖玻片，观察细胞生长至对数生长期时，4℃放置1h同步化，药物处理3h，洗去药液换培养液继续培养8h，用40g L-1 PFA（pH7.4）室温固定30min，0.01mol L-1 PBS洗3次，每次5min，用1g L-1 Triton X-100，1g L-1 枸橼酸钠在冰上处理2min，加50μL TUNEL反应液，上覆parafilm，暗处湿盒中37℃孵育1h，0.01mol L-1 PBS洗3次，每次5min，荧光显微镜观察，摄像. 

　　1.2.3 激光共聚焦显微镜检测 

　　将TUNEL法标记标本用488nm激发FITC，共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的Lasersharp软件控制，图像存为512×512像素类型.
    
　　2 结果
   
　　2.1 MTT试验 

　　各实验组与空白对照组间差异有显著性（P<0.01）.各实验组间，表阿霉素与阿霉素相同处理组之间无显著性差异（P>0.05，Tab1）. 表1 MTT试验结果（略０
  
　　2.2 形态学改变 

　　倒置显微镜下对数生长期的HCC-9204肝癌细胞呈铺石状镶嵌紧密排列，细胞呈三角形、多边形、椭圆形等各种形态，生长活跃，经20μmol L-1 表阿霉素或阿霉素处理后细胞间可见排列疏松、细胞形态变圆、体积变小、折光性差、核浆比例变大，有较多漂浮的细胞，呈桑椹样，膜表面呈小泡样突起（芽生），部分细胞似卫星样（凋亡小体），动态观察两组细胞形态有类似改变.空白对照仅见少量漂浮的细胞，无形态学改变.荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察TUNEL标记的凋亡细胞，细胞核呈肾形或月牙形，部分核呈缢断像、核边集、核不均值、固缩核形态大小不等、核浆比值增大、胞质少、细胞变圆、核内染色质浓集成块，有的肝癌细胞崩解，可见无核质圆形小体，细胞及细胞核呈黄绿色（Fig1～3）.

　　2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳 

　　紫外灯下观察，HCC-9204肝癌细胞经表阿霉素或阿霉素20μmol L-1 作用3h，换液培养8h后，DNA琼脂糖凝胶电泳均可见有不连续的电泳条带，呈梯状结构，分子大小为几百个bp.两组条带无明显差别.
    
　　2.4 流式细胞仪检测 

　　表阿霉素组和阿霉素组均出现典型的凋亡峰，凋亡细胞分别占细胞总数的13.8%和13.1%，无明显差异.细胞周期检测:表阿霉素组G1 期、G2 期和S期分别为56.4%，10.4%和38.2%;阿霉素组分别为61.1%，8.6%和30.3%;对照组分别为31.1%，61.9%和6.0%.epirubicin
    
　　3 讨论
    
　　细胞凋亡的研究在肿瘤发生及肿瘤预防中起着重要作用［3-5］ .检测细胞是否发生凋亡，形态学观察是最可靠的方法.我们通过多种方法获得的实验结果符合细胞凋亡的形态学特征.经20μmol L-1 表阿霉素或阿霉素处理的HCC-9204肝癌细胞倒置显微镜下观察可见细胞间排列疏松、细胞形态变圆、体积变小、核浆比例变大，有较多漂浮的细胞，部分细胞似周围见卫星样小体（凋亡小体）;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察TUNEL标记的凋亡细胞其细胞核呈肾形或月牙形，核边集、核不均值、固缩核形态大小不等、核内染色质浓集成块、部分核呈缢断像，胞质少、核浆比值增大、细胞及细胞核呈黄绿色.两处理组细胞形态相似，改变类同.

　　检测细胞凋亡核小体DNA片段的方法常用DNA片段琼脂糖凝胶电泳法、TUNEL及ISNT（in situ nick translation，原位缺口平移）法，单细胞凝胶分析-慧星分析、流式细胞仪检测.本研究采用琼脂糖凝胶电泳、TUNEL和流式细胞仪分析法结合细胞形态学判断对表阿霉素和阿霉素处理肝癌HCC-9204细胞后的影响，发现电泳结果出现梯状带型，TUNEL标记凋亡细胞核呈各种形状，流式细胞仪发现DNA直方图上出现DNA含量减少的亚二倍体峰-凋亡峰.证明了两药物均可诱导肝癌细胞发生 凋亡.
    
　　TUNEL法可较容易地用于培养细胞的检测，被称为检测细胞凋亡的“石蕊试验”.一般认为凋亡细胞双链DNA断裂发生早于非特异性DNA断裂，且明显多于单链DNA断裂，故凋亡早期即可检测［5］ .本研究经药物处理后TUNEL标记，其荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察两组细胞均发生凋亡，但处理时间较短［6］ ，结合流式细胞仪分析、凋亡细胞所占百分比以及细胞周期各期分布有所不同，故推测其凋亡细胞为凋亡早期细胞.
   
　　人肝癌细胞株HCC-9204细胞对20μmol L-1 表阿霉素或阿霉素暴露后，经流式细胞仪分析发现两药处理组G1 期细胞比对照组约增加1倍，G2 期细胞比对照组减少约6至7倍.细胞生长明显受阻于G2 期.提示根据药物对肝癌细胞周期各期的影响，在临床上可以更好地选择不同的化疗药物，联合用药以增加疗效、减少副作用.近年来对抗肿瘤药物治疗中细胞凋亡作用和机制的不断研究，已证明多数化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡达到清除肿瘤的目的［7］ .但有关阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的研究不多，而关于表阿霉素和阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的比较研究尚未见报道.表阿霉素和阿霉素的结构区别只是氨基糖部分4'位的羟基由顺式变成了反式，作用机制和临床抗瘤谱相似，但前者具心脏和骨髓毒性较低等优点［8］ ，因此，我们通过实验比较两药对肝癌细胞凋亡的影响，证实两药同等剂量、同等时间诱导肝癌细胞发生凋亡所致形态学及生化指标观察无明显差别，提示:①表阿霉素和阿霉素均能有效地诱导肝癌细胞凋亡，是有效的抗肝癌化疗药物;②两药在诱导肝癌细胞凋亡的作用和效果方面无显著差异;③因表阿霉素对心脏和骨髓毒性较阿霉素低，可大剂量用药，故临床上选择表阿霉素可能优于阿霉素.

　　抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的具体机制尚不清楚，对于刺激与效应之间的联系研究较少，因此对细胞凋亡及其与生长因子、癌基因和抑癌基因的关系进一步研究，将对认识肿瘤发生机制及肿瘤的预防和治疗产生深远的影响.

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