Fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素（MSH）的工艺研究
【关键词】 固相合成；肽类；MSH；芴甲氧羰基
【Abstract】 AIM: To study the process and influencing factors of synthesizing the melanocyte stimulating hormone（MSH） peptide by Fmoc solidphase synthesis. METHODS: With Fmoc to protect the αamino acid, TBTU/HOBT/DIEA were used as coupling reagents to synthesize the peptide of MSH. The synthesized peptide was purified by the chromatograph and identified by mass spectrograph. RESULTS: The peptide yield was 63%.The synthesized peptide purity reached to 98.67% after being purified by RPHPLC. The molecular mass of the synthesized peptide was 1663.88 ku by MALDIMS and it was consistent with the theoretic molecular mass of 1664.08 ku. CONCLUTION: This method of synthesis is rapid，simple and effective for the peptide MSH, and its fit for the largescale production.
【Keywords】 solidphase synthesis; peptides; MSH; Fmoc
【摘要】 目的： 研究9芴甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)工艺的步骤及其影响因素. 方法： 采用Fmoc保护α氨基，以TBTU/HOBT/DIEA为缩合剂合成MSH. 用色谱仪和质谱仪对合成的多肽进行纯化、鉴定. 结果： 多肽合成的得率可达63%，经反相高效液相色谱仪（RPHPLC）对合成的多肽进行纯化后可得纯度为98.67%的目标肽. 通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪（MALDIMS）检测所合成多肽的分子质量为1663.88 ku，与其理论分子质量1664.08 ku相符. 结论： 该合成法具有快捷、简便、高效地合成多肽MSH的特点，适合大批量生产.
【关键词】 固相合成；肽类；MSH；芴甲氧羰基
0引言
多肽作为生物体内的重要组成部分之一，在体内各脏器中有许多复杂而特殊的生理活性［1］. 黑色素细胞刺激素(MSH)是由13个氨基酸组成的一种内源性的神经免疫调节肽，可抑制发热与主要类型的实验性炎症. 固相法作为多肽合成领域的一个重大突破在合成多肽MSH中具有快速、简便、高效等优点［2］，但需要对不参与反应的氨基加以保护，同时氨基酸的侧链上的活性基团也要给予保护. 保护基的选择既要保证侧链基团不参与反应，又要保证在肽链合成过程中不受破坏，同时还要保证在最后肽链裂解时能被除去［3］. 国内外经常采用叔甲氧基（Boc）保护α氨基，却难以合成对酸不稳定的多肽. 由于本次合成的多肽MSH中含有色氨酸，对酸不稳定. 我们旨在采用9芴甲氧羰基（Fmoc）基团保护α氨基以合成MSH.
1材料和方法
1.1材料RPHPLC型高效液相色谱仪(Beckman公司);基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪（MALDIMS，Hewleftpackar公司）；台式离心机（北京仪器六厂）；台式冻干机（军事医学院四环仪器厂）；Fmoc保护的氨基酸（Merck公司）；1羟基苯并三氮唑（HOBT），1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（TBTU ,ABI公司）；二异丙基乙胺（DIEA），三氟乙酸（TFA,Sigma公司）；乙腈（Fisher公司）；NN二甲基甲酰胺（DMF），二氯甲烷（DCM），异丙醇，FmocRink AmideMBHA Resin［吉尔生化（上海）有限公司］.
1.2方法
1.2.1树脂的选择根据导入反应基团的不同，可以把树脂分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或烯肼型树脂等［4］. 本次Fmoc固相合成的MSH的末端需要酰氨化,故需要选用一种Rink氨基树脂即Rink AmideMBHA Resin，在Rink Amide MBHA Resin中加入缩合剂TBTU/HOBT/DIEA使MSH的Val与树脂之间形成酰胺键，以此来完成氨基酸的固定.
1.2.2FmocValOH 与FmocRink AmideMBHA Resin的连接根据合成多肽的序列，将Rink AmideMBHA Resin置于已用DCM浸泡过的反应器中，加入DMF浸泡30 min左右，使其充分膨胀，然后用含200 mL/L哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，再用异丙醇洗涤树脂2次，最后用DMF洗涤树脂3次，当用50 g/L茚三酮检测呈阳性时将FmocValOH， TBTU， HOBT, DIEA及DMF配成的反应液加入到树脂中，室温下反应1.5 h，当用茚三酮检验呈阴性时再用异丙醇、DMF溶液各洗涤2次. 即完成第1个氨基酸与树脂的连接.
1.2.3接肽反应选用的接肽反应缩合剂为具有缩合效率高、反应速度快、不易发生消旋化反应的TBTU/ HOBT/DIEA的混合液［5］,反应时间约为1.5 h，每次反应后取少量树脂用茚三酮法检测，若呈阳性说明反应不完全，继续加入缩合剂，使其充分反应. 若呈阴性说明反应完全，用含200 mL/L哌啶的DMF溶液脱除新接入氨基酸的Fmoc基团以便于下一个氨基酸的羧基反应. 重复此过程至MSH中所有氨基酸全部接入.
1.2.4MSH－树脂的切割MSH合成完毕后，用N2吹干MSH树脂，将其置于反应器中，加入切割试剂（10 mL TFA，0.5 mL苯甲硫醚，0.25 mL巯基乙醇，0.5 mL水，0.75 g苯酚），室温下磁力搅拌反应3 h左右，使MSH与树脂分离，再经砂芯过滤，将滤液加入冰乙醚中析出多肽，最后经离心分离获得MSH粗品.
1.2.5MSH的纯化和质谱鉴定多肽合成过程中的各种副反应、消旋化以及脱保护的过程中由于保护基的残留、肽键的断裂、烷基化等原因会造成产品不纯. 根据目的肽的要求可采用适当的方法进行纯化. 我们选用的是具有快速、高效和较高回收率等特点的RPHPLC进行纯化［6］，采用MALDIMS鉴定所得产品.
2结果
2.1а氨基保护基团的选择及其脱除绘制Fmoc基团的脱除效果与哌啶的含量及其脱除时间关系曲线，可以看出随着哌啶含量的增加，脱除反应速度在加快，本次合成选用含200 mL/L哌啶的DMF溶液反应25 min，脱除率在99%以上，可以很好的脱除Fmoc保护基团（图1）.
图19芴甲氧羰基的脱除率与哌啶含量及脱除时间的关系（略）
2.2MSH粗品的分析图色谱图中峰数较多，利用色谱工作站软件可知，合成的多肽粗品中，主峰物质占68%（图2）.
PRHPLC色谱条件： 4.6 mm×25 cm(c18,反相)； 流动相中A液: 1 mL/L三氟乙酸的纯水溶液，B液: 1 mL/L三氟乙酸的乙腈溶液；梯度洗脱方式: 900 mL/L A液+100 mL/L B液在30 min内降为100 mL/L A液+900 mL/L B液， 流速: 1 mL/min； 检测波长: 215 nm.
图2MSH粗品的色谱图（略）
2.3MSH粗品的质谱检测MSH粗品的质谱分析结果显示，质谱图中主峰显示的分子质量为1663.88 ku，与MSH的理论分子质量1664.08 ku接近，说明MSH粗品中含有MSH(图3).
图3MSH粗品的质谱图（略）
2.4MSH的纯化及纯化后的色谱分析在RPHPLC纯化过程中选用的离子对为三氟乙酸（TFA）. 从多肽MSH纯化后的色谱分析结果可以看出，主峰面积较大，其他峰面积与主峰相比较小（图4），表明合成的粗品经RPHPLC纯化后可能会得到较纯的MSH.
2.5MSH纯化后的质谱鉴定MALDIMS分析的结果显示，实际合成的多肽分子质量为1663.88 ku，与MSH的理论分子质量1664.08 ku相差无几. 同时也可以看出，图中峰数很少，而且主峰明显，说明本次合成的MSH经色谱仪纯化后，可以除去大部分的杂质，从而得到较纯的MSH（图5）.
PRHPLC色谱条件： 4.6 mm×25 cm(c18,反相)； 流动相中A液: 1 mL/L三氟乙酸的纯水溶液，B液: 1 mL/L三氟乙酸的乙腈溶液；梯度洗脱方式: 900 mL/L A液+100 mL/L B液，在30 min内降为100 mL/L A液+900 mL/L B液； 流速: 1 mL/min; 检测波长: 215 nm.
图4MSH纯化后的色谱图（略）
图5MSH纯化后的质谱图（略）
3讨论
用于合成多肽的树脂具有多种类型，实际合成中要根据合成多肽的特点，选择合适的树脂作为载体,由于MSH的末端需要酰氨化,所以选用Rink AmideMBHA Resin,这种树脂具有稳定的理化性质、足够多的反应位点及副反应少等优点，可以提高产物得率，降低纯化成本.
固相合成通常采用Boc和Fmoc两种策略对α氨基加以保护［7］,与Boc法相比，Fmoc法更适合合成对酸不稳定的多肽, 而且具有反应条件温和、副反应少、可以大量合成等优点. 由于本次合成的多肽MSH，其中含有的色氨酸对酸不稳定，所以要选择Fmoc基团对α氨基进行保护.
DCC是多肽合成中常用的一种缩合试剂，但它往往会伴随一些副反应，这样会降低产物得率，提高纯化成本. TBTU/ HOBT/DIEA作为新型的复合型缩合试剂，是减少在肽链延伸过程中这些副反应产生的有效方法，同时也具有反应快速，缩合条件温和以及产物易于纯化等特点，所以可以达到提高产物得率，降低纯化费用的目的，便于多肽MSH的产业化生产［8］.
合成多肽MSH时，在每一步反应完成后，下一个氨基酸接入之前，需要脱除Fmoc基团，通常采用哌啶的DMF溶液，其脱除效果与哌啶含量有关，200 mL/L哌啶的DMF溶液与100 mL/L哌啶的DMF溶液相比，脱除时间较短，脱除效果却更好，但当哌啶含量过大时，就会因反应过于剧烈而出现副反应，这样不利于脱除后的洗涤. 所以我们采用的是200 mL/L的DMF溶液.
Fmoc固相法合成多肽MSH，首先采用RPHPLC对粗品进行分析，确定粗品分析图中主峰物质的含量并将其作为样品进行质谱分析，再采用RPHPLC对其进行纯化，可以得到98.67%的高纯度产物，最后经MALDIMS鉴定，主峰显示的分子质量为1663.88 ku，与MSH的理论分子质量1664.08 ku接近. 由于采用Fmoc基团保护а氨基，选用TBTU/HOBT/DIEA作为缩合剂，可以有效的提高MSH的合成效率. 因此，采用本合成工艺合成多肽MSH具有反应条件温和，缩合效率高以及合成成本低的特点，适合于大规模生产.
【】
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