成年及新生大鼠面神经结扎后NADPH
【关键词】 大鼠；面神经；结扎术；NADPH脱氢酶；组织化学
Different expression patterns of NADPHd positive neurons after facial nerve ligation in neonatal and adult rats
【Abstract】 AIM: To establish the neonatal and adult rat models of facial nerve ligation and observe the dynamic changes of NADPHd positive neurons in the facial nucleus after ligation. METHODS: The neonatal and adult rats facial nerve was ligated at stylomastoid foramen. Brain tissues 3, 7, 14, 21, 28, 56, 84 d after operation respectively were prepared for pathological sections of facial nuclei and then the sections were stained with NADPHd for observing the morphological change of facial motoneurons(FMN). RESULTS: The number of NADPHd positive FMN increased significantly in adult rats from 3 d to 12 wk after facial nerve ligation, while the NADPHd positive FMN in neonatal rats was found in the lesion side during 18 weeks after ligation. CONCLUSION: After facial nerve ligation, the number of NADPHd positive FMN increased in both the neonatal and the adult rats, while their expression patterns are quite different in these 2 groups.
【Keywords】 rats; facial nerve; ligation; NADPH dehydrogenase; histochemistry
【摘要】 目的： 研究新生及成年大鼠面神经结扎后，面神经核运动神经元（FMN）NADPHd阳性细胞的动态变化. 方法： 于新生及成年大鼠茎乳孔处结扎面神经，于3, 7, 14, 21, 28, 56, 84 d采用NADPHd组织化学方法观察NADPHd阳性细胞在面神经核中的变化. 并观察NADPHd阳性细胞与存活神经元之间的关系. 结果： 成年大鼠面神经结扎FMN受损后，3 d~12 wk NADPHd阳性持续表达. 但是幼年大鼠面神经结扎FMN受损后1 wk，NADPHd阳性方可在损伤侧观察到，至8 wk则几乎观察不到NADPHd阳性FMN. 结论： 面神经损伤后，成年及新生大鼠损伤侧NADPHd阳性FMN数目均有所增加，但是它们在表达时程上显示了不同的模式.
【关键词】 大鼠；面神经；结扎术；NADPH脱氢酶；组织化学
0引言
NO参与神经系统的生理和病理过程，但出生后正常运动神经元NO合酶(NOS)表达阴性［1］. 坐骨神经切断的研究表明，新生大鼠相应运动神经元大量死亡，NOS表达增高，成年大鼠相应运动神经元则无显著变化. 提示NOS的表达可能与神经元的变性坏死相关联［2］. 神经系统中NADPH脱氢酶(NADPHd)与NOS是同一种酶，因而采用NADPHd组织化学的方法可以间接显示NOS的分布. 我们通过NADPHd组织化学的方法［3］，研究不同年龄大鼠面神经损伤后，其神经元NOS表达模式的变化以及NOS表达和存活神经元之间的关系.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠42只(第四军医大学实验动物中心提供) ，雌性，体质量(200 ±10) g ，面神经压榨伤7组(3, 7, 14, 21, 28, 56, 84 d) ，每组6只. 成年大鼠手术方法参照，建立以左侧面神经断裂为实验对象的动物模型. 麻醉(10 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg) 大鼠，暴露左侧茎乳孔及面神经干，使用手术线于距茎乳孔1.5 mm处结扎面神经，右侧为正常对照. 新生SD大鼠42 只(第四军医大学实验动物中心提供),全部产自7只母鼠，于出生后7 d，低温麻醉（-20℃, 20~30 min），在其左侧面部的腮腺下方暴露面神经，结扎其主干［4］. 术后新生鼠与其母鼠以12 h∶12 h间隔喂养. 全部动物按时给予食物和水，并经不同存活时间，在10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg) ip麻醉下开胸，左心室升动脉插管，灌注温生理盐水100 mL冲净血液，然后用预冷的40 g/L多聚甲醛固定液（pH 7.4）500 mL灌注，固定完毕，参照文献［5］定位面神经核，水平面切取一块5 mm脑干(以桥延沟为中心)后固定2 h,入200 g/L蔗糖溶液4℃过夜，至组织块下沉，冰冻冠状切片14 μm.
1.2方法切片经10 mmol/L PBS漂洗3×5 min后，在含有TritonX100, 0.6 g/L NADPHd和0.5 g/L硝基四氮唑蓝（NBT）的PB液(pH 8.0)中37℃孵育40～60 min, 10 mmol/L PBS终止反应. 并使用中性红复染，贴片，脱水，透明，封片. 每只动物随机取5张切片，在BX60（X100）下计数面神经核团内神经元（FMN）. 左右两侧面神经核团中中性红阳性神经元数目之比（L/R）为存活率. 损伤侧NADPHd染色阳性神经元于同侧中性红阳性神经元数目之比为相对阳性率，损伤侧NADPHd染色阳性神经元于对照侧中性红阳性神经元数目之比为绝对阳性率.
统计学处理： 实验结果用x±s表示，采用Origin7.0软件，组内比较统计学处理用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义.
2结果
2.1成年大鼠面神经切断后1 wk，神经元存活数目变化不大，但1~12 wk之间，存活神经元从对侧的95.8%下降至68.8%(图1）. 此后，神经元数目变化不大，至16 wk，依然有66.3%的神经元存活. 成年大鼠面神经损伤3 d，损伤侧面神经核内即可见NADPHd阳性神经元，但是其染色比较浅淡，并且有NADPHd染色阳性的血管. 从损伤后1 wk开始，损伤侧面神经染色较深；NADPHd阳性神经元数目在损伤后2 wk达到最高，并且此后直至12 wk,损伤侧始终有25%以上（相对比率）的神经元NADPHd染色阳性（图2）.
图1大鼠面神经结扎后损伤侧面神经核团内神经元的存活率 aP<0.05（略）
2.2幼年大鼠新生大鼠面神经损伤1 d后，损伤侧面神经元尼氏体开始崩解，核固缩，但是和对照侧相比，FMN数目没有显著差异. 损伤后3 d开始，损伤侧FMN存活细胞开始减少，只有对照侧的93%；背景出现NADPHd染色阳性的血管，但是未观察到NADPHd阳性神经元. 从损伤后1 wk开始，损伤侧FMN存活数目明显降低，大约只有对照侧的50%；并且除了背景血管NADPHd染色阳性以外，损伤侧开始出现NADPHd阳性的神经元. 至2 wk，尽管损伤侧只有对照侧57.7%的FMN依然存活，但是其NADPHd阳性神经元的相对及绝对比率都最大（表1）. 此后，面神经核内NADPHd阳性神经元数目急剧下降，并且至8 wk，只有个别动物损伤侧依然存在NADPHd阳性神经元. 而至12 wk，检查的所有5只动物损伤侧均未发现NADPHd阳性神经元（图3）. 对于新生大鼠，神经元死亡的主要时间发生于损伤后3 d至1 wk，损伤侧大约有33%的神经元在此期间死亡. 而之后，损伤侧存活神经元数目虽然随着时间持续减少，但是减少的趋势已经减缓.
A： 3 d; B: 1 wk; C: 2 wk; D: 12 wk. Bar=100 μm.
图2成年大鼠面神经结扎后面神经核内的NADPHd阳性神经元（略）
A： 3 d; B: 1 wk; C: 2 wk; D: 8 wk. Bar=100 μm.
图3新生大鼠面神经结扎后面神经核内的NADPHd阳性神经元（略）
表1面神经结扎后核团内NADPHd阳性神经元的变化（略）
3讨论
我们发现，幼年大鼠从损伤后3 d开始就有大量的神经元死亡，而成年大鼠则从1 wk开始神经元的死亡才比较显著. 尽管成年及新生大鼠面神经结扎之后，其FMN均有死亡，NADPHd阳性细胞数目均增加，但是它们的反应模式是不同的. 这种差异可能反映了不同发育阶段神经元对同一损伤的不同反应，其死亡可能是由不同的机制介导的. 成年运动神经元对神经营养因子的依赖程度较低，因此轴突切断之后的神经营养因子缺乏并没有成为成年大鼠FMN死亡的直接原因. 其神经元的死亡和NADPHd的表达正相关，因此，使用iNOS的抑制剂可以有效地减少成年大鼠FMN的死亡［6］. 而对于幼年大鼠，损伤1 wk内即有大量神经元死亡，但在损伤后1 wk才有NADPHd阳性神经元出现，说明NO并不是幼年大鼠FMN早期死亡的主要原因. 我们推测，幼年大鼠面神经结扎后，其早期的神经元死亡占主要作用，而这一过程是不依赖于iNOS的. 而成年大鼠面神经结扎后，神经元内诱导产生的iNOS是引起其死亡的主要因素，因此可以考虑使用iNOS的抑制剂.
【】
［1］ Michel O, Hess A, Krolzig M, et al. Involvement of nitric oxide synthase in the physiology and pathophysiology of facial nerve function and dysfunction［J］. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2000,257(4):188-192.
［2］ Ruan RS, Leong SK, Yeoh KH. The role of nitric oxide in facial motoneuronal death［J］. Brain Res,1995,698(12):163-168.
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［5］ Choi D, Dunn LT. Facial nerve repair and regeneration: An overview of basic principles for neurosurgeons［J］. Acta Neurochir, 2001,143(2):107-114.
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