胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞增殖和ERK表达的影响
作者：姜志茹，龚均，张珍妮，曾文斌
【关键词】 胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类
Influence of bile acid on proliferation and ERK expression in human normal esophageal epithelial cells
【Abstract】 AIM: To observe the influence of bile acid on cell proliferation and the expression of extracellular signalregulated protein kinase (ERK) in human normal esophageal epithelial cells in vitro. METHODS: Human normal esophageal epithelial cells cultured in vitro were exposed to media containing 6 different kinds of bile acids (250 μmol/L) respectively for 360 min, in comparison with the control group (in normal media without bile acid). Cell proliferation was assessed using MTT and flow cytometry. The expression of phosphorylated ERK1/2 protein was determined by the immunoblotting technique. RESULTS: Bile acidexposed (312 min) esophageal epithelial cells exhibited a significant increase in proliferation, especially in S phase of the cell cycle, and the level of phosphorylated ERK1/2 protein. While the bile acidexposed period exceeded 20 min, esophageal epithelial cells exhibited a degression in proliferation and proportion on S phase of the cell cycle. CONCLUSION: The brief exposure in bile acid increases the proliferation in human normal esophageal epithelial cells by activating the ERK pathway.
【Keywords】 cholic acid; esophagus/cytology; cell proliferation; extracellular signalregulated MAP kinases
【摘要】目的： 观察胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响. 方法： 体外培养人正常食管黏膜上皮细胞，分别在含有6种不同胆酸（250 μmol/L）的培养液中培养3~60 min，并设对照（培养液不含胆酸）进行比较. 采用MTT法和流式细胞技术测定细胞增殖状态. 免疫印迹法测定磷酸化ERK1/2蛋白表达. 结果： 胆酸的短时间（3~12 min）作用使细胞增殖比大于1，S期细胞比率升高，磷酸化ERK1/2蛋白表达增加. 当作用时间大于20 min时，细胞增殖比和S期细胞比率下降. 结论： 胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK表达上调有关.
【关键词】 胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类
0引言
近年来随着国内外食管反流性疾病的增加，对十二指肠胃食管反流的研究日渐深入. 反流物中的胆汁主要由胆酸组成，胆酸在反流性食管炎、Barrett食管以及食管腺癌的发生过程中起着重要作用［1］. 目前胆酸对食管细胞作用的信号传导机制研究尚少. 丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)是细胞内信号转导的重要信号分子，细胞外信号调节蛋白激酶 (extracellular signalregulated protein kinase, ERK)是MAPK通路的主要途径之一，与细胞的增殖凋亡有关［2］. 为了进一步探讨胆汁反流的致病机制，本文首次研究了胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响.
1材料和方法
1.1材料人角朊细胞培养液KSFM（keratinocyte serumfree medium）及牛垂体提取物（BPE）,重组表皮生长因子（rEGF）（Gibco公司）. 甘氨胆酸钠(GC),甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC),牛磺胆酸钠(TC),牛磺鹅脱氧胆酸钠(TCDC),胆酸(CA)及脱氧胆酸(DCA)（Sigma公司），分别溶于KSFM制成250 μmol/L的胆酸溶液. 抗人细胞角蛋白14单克隆抗体（CK14）（上海长岛生物有限公司）. 抗磷酸化ERK1/2抗体、抗ERK1/2抗体（美国CST公司）. RIPA细胞裂解试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）. BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒（美国Pierce公司）.
1.2方法
1.2.1细胞培养、鉴定和分组取材于食管癌手术切除的正常食管黏膜组织，进行病理检验，仅选取病理诊断正常的标本进行细胞培养. 标本获取经患者同意. 标本采用无菌收集，保存于4℃无菌KSFM，4 h内进行原代细胞培养，具体操作参照已有的方法［3］. 获取的食管上皮细胞于KSFM（无血清培养液，含有BPE和rEGF）中，在37℃, 50 mL/L CO2条件下培养. 第1次传代培养后进行CK14的免疫细胞化学染色鉴定细胞. 实验组细胞于无BPE和rEGF的KSFM中同步化培养48 h后，分别在6种胆酸溶液中培养3~60 min. 以正常培养液中培养的细胞为对照组.
1.2.2细胞增殖分析将细胞接种于96孔板，5×103细胞/孔. 胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24 h, MTT法检测细胞增殖情况. 在每孔培养液中直接加入10 μL MTT溶液 (5 mg/mL)，4 h后弃去培养液，用100 μL二甲基亚砜裂解细胞. 于490 nm测定吸光值，细胞增殖比，增殖比=实验组吸光值/对照组吸光值.
1.2.3细胞周期观察将细胞接种于6孔板，5×105细胞/孔. 胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24 h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤一次. 每个样本约106个细胞，加入750 mL/L冷乙醇固定4℃保存. 以50 μg/mL核糖核酸酶和50 μg/mL碘化丙啶染色，流式细胞仪（FACSCalibur型，美国BD公司）观察G1, S和G2相的细胞比率，以及细胞凋亡率.
1.2.4磷酸化ERK1/2蛋白水平的测定采用Western免疫印迹法. 细胞经胆酸作用3 min后，依据RIPA试剂盒说明书提取细胞内总蛋白，BCA法检测蛋白浓度. 以50 μg蛋白上样进行10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V恒压电泳约25 min，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处换120 V恒压电泳约1 h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部. 电转法(110 V，3 h)将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上，分别与抗磷酸化ERK1/2抗体（1∶1000稀释）、抗ERK1/2抗体（1∶1000稀释）4℃孵育杂交过夜. ECL法检测蛋白条带，X线曝光. 凝胶电泳分析系统定量条带相对灰度，以磷酸化ERK/总ERK比值判断结果.
统计学处理： 每组实验独立重复3次. 实验结果以x±s表示. 多组均数比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05时有统计学差异.
2结果
2.1人正常食管黏膜上皮细胞的生长特性细胞单层贴壁生长，卵圆形. CK14是食管上皮细胞的骨架蛋白，免疫细胞化学染色显示第2代细胞均表达CK14.
2.2人正常食管黏膜上皮细胞在胆酸作用下的形态学变化相差显微镜下（×250）观察发现，对于GC, GCDC, TC, TCDC, CA五个实验组，细胞在胆酸作用（3~60 min）前后无明显形态学变化. DCA组当作用时间为3~20 min时，细胞在DCA作用前后无明显形态学变化；当作用时间超过40 min时，部分细胞出现折光性减低、细胞皱缩.
2.3细胞增殖测定测定结果如图1, GC, GCDC, TC, TCDC, CA 五个实验组的增殖比为0.952±0.154~1.344±0.139，增殖比大于1或略小于1，呈增殖趋势. DCA组当作用时间为3~12 min时，增殖比为1.114±0.163~1.346±0.170，大于1呈增殖趋势；当作用时间大于20 min时，增殖比为0.791±0.108~0.431±0.109，小于1呈凋亡趋势.
2.4细胞周期测定检测结果如表1，当胆酸作用时间为3, 12 min时，GC, TC, CA, DCA四个实验组的S期细胞比率高于对照组(P＜0.05)，各组间的凋亡率无明显差异. 当胆酸作用时间为40 min时，GC, TC, CA组的S期细胞比率、凋亡率与对照组相比均无明显差异；但DCA组的S期细胞比率降低，凋亡率明显增加(P＜0.05).
2.5磷酸化ERK1/2的表达如图2所示，当胆酸作用时间为3 min时，与对照组相比，各实验组的磷酸化ERK1/2表达增加(P＜0.05). GC作用3 min后0, 5, 15, 30 min时分别测定磷酸化ERK1/2表达(图3)，GC作用刚刚结束时磷酸化ERK1/2表达最高水平，随时间延长表达水平逐渐下降，15 min以后接近对照组水平.
图16种胆酸作用3~60 min对细胞增殖比的影响（略）
表1胆酸作用3, 12, 40 min对S期细胞比率、凋亡率的影响（略）
aP＜0.05 vs对照.
图2胆酸作用3 min对各组ERK表达的影响（略）
图3GC作用后30 min内的ERK表达（略）
3讨论
近年来的研究发现反流性食管炎、Barrett食管均存在细胞增殖提高［4］，就此有学者研究了酸对细胞增殖的影响，发现酸可使体外培养的BE组织［5］和Barrett相关腺癌细胞系(SEG1)的细胞增殖率升高［6］. 随后有研究表明，GCDC的短时间作用（20 min）也对SEG1细胞具有促增殖效应［7］. 这提示反流物可能是通过引起增殖异常导致了食管炎症、肠化、癌变一系列病变的发生. 由于人正常食管上皮细胞的原代培养在很长一段时间内存在问题，既往的报道均局限于病理状态下食管细胞的研究. 我们通过新近建立起来的人正常食管上皮细胞的原代培养技术［3］，第一次报道了胆酸对人正常食管上皮细胞增殖的影响，以进一步探讨反流性疾病的发病机制.
我们将正常食管上皮细胞分别于4种结合胆酸和2种非结合胆酸中培养3~60 min，基于Barrett食管患者的食管抽吸物中的平均胆酸浓度［8］我们选取了250 μmol/L的作用浓度. 结果显示胆酸的短时间作用提高了人正常食管细胞的增殖. 细胞形态的观察发现，GC, GCDC, TC, TCDC, CA五种胆酸作用3~60 min前后细胞无明显形态学变化，但DCA作用时间超过40 min时，细胞出现折光性减低、细胞皱缩的凋亡改变. 细胞增殖测定表明，胆酸的短时间作用（3~12 min）使得24 h的细胞增殖比大于1，随作用时间延长细胞数有所减少，DCA组减少尤为明显，表明DCA较其他五种胆酸对细胞的毒性作用更大. 细胞周期的测定结果进一步证实了上述增殖改变，胆酸作用3, 12 min时S期细胞比率升高，作用40 min时S期细胞比率降低，DCA组降低尤为明显，并伴有凋亡率增加.
上述结果提示胆酸对食管细胞的作用具有一定的时效性，即短时间作用产生促增殖效应，长时间作用引起凋亡改变. 临床上食管内的胆汁反流具有间断性、反复性的特点，因此我们认为胆酸引起的增殖凋亡异常对反流性疾病的发病机制具有重要意义. 既往对胆酸毒性作用的报道很多，相关作用机制的研究也十分广泛深入，但对胆酸诱导增殖的机制报道尚少. 我们从信号转导机制方面研究了ERK通路与胆酸诱导增殖的关系，以进一步探讨胆酸诱导增殖的可能机制.
MAPK通路主要有4条途径，ERK是其中研究得较为彻底的一条通路. ERK在所有的真核细胞中都表达，正常情况下以非活性形式位于胞质，受到理化因素刺激时被激活而转位入胞核，参与了细胞生长、发育、分裂等生理过程，并在细胞增殖、凋亡、恶性转化等病理过程中起重要作用［2］. 我们发现胆酸诱导正常食管细胞增殖与ERK表达上调有关. 当胆酸作用时间为3 min时，与对照组相比，各实验组的磷酸化ERK 表达增加，胆酸作用刚刚结束时磷酸化ERK达最高水平，随时间延长表达水平逐渐下降，15 min以后接近对照组水平，表明胆酸对正常食管细胞的促增殖作用可能是通过ERK路径.
我们认为，胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK表达上调有关. 由此我们推测胆汁反流可能是通过ERK介导的细胞增殖异常，导致反流性食管炎、Barrett食管乃至腺癌的发生.
【】
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