咪喹莫特对小鼠哮喘模型气道炎症和STAT6表达的影响
作者：金淑贤，殷凯生，卞涛，陈子庆
【关键词】 哮喘
Effects of imiquimod on airway inflammation and STAT6 expression in mouse models of asthma
【Abstract】 AIM: To observe the effects of aerosol imiquimod on the antigeninduced airway inflammation and the expressions of Th2type chemokines Eotaxin, macrophagederived chemokine (MDC) and thymus and activation regulated chemokine (TARC) in mouse models of asthma. METHODS: Imiquimod and dexamethasone were administered to immunized mice before antigen challenge. At 24 h after the final OVA inhalation, the left superior lung tissue was taken, HE stained and the changes of inflammation were observed. Bronchial alveolar lavage fluid (BALF) was collected to count the number of cells and classify them. The expressions of signal transducers and activators of transcription 1(STAT1) and signal transducers and activators of transcription 6(STAT6) in lungs were detected by immunohistochemistry and western blot. The mRNA expressions of STAT1, STAT6, IL4, eotaxin and IFNγ in lungs were examined by reverse transcriptasepolymerase chain reaction. RESULTS: ① Imiquimod and dexamethasone attenuated the airway inflammation of asthmatic mice. ② Imiquimod decreased the totol cell counts, EOS and lymphocyte counts in BALf. ③ The expressions of STAT1 and STAT6 were mainly on the bronchial epithelium. STAT1 and STAT6 proteins and mRNA levels increased in lung tissues in asthma group. Imiquimod significantly reduced STAT1 and STAT6 protein and mRNA expression. Dexamethasone significantly reduced the levels of STAT6 protein and mRNA, but failed to inhibit the expression of STAT1. ④ Imiquimod modulated the Th1/Th2 response by enhancing Th1 cytokine IFNγ mRNA and inhibiting the Th2 cytokine IL4 mRNA expression in lung tissues. CONCLUSION: Imiquimod aerosol inhalation may inhibit antigeninduced airway inflammation and decrease the over expression of STAT6 protein and mRNA in asthmatic mouse but has no influence on STAT1 expression.
【Keywords】 asthma; signal transducers and activator of transcription 1; signal transducers and activator of transcription 6; imiquimod
【摘要】 目的： 观察咪喹莫特对小鼠哮喘模型气道炎症和肺组织信号转导与转录激活因子1（STAT1）和STAT6表达的影响. 方法： 建立哮喘模型，自14 d时雾化吸入OVA前0.5 h， 干预组分别雾化吸入咪喹莫特30 min及ip地塞米松. OVA雾化结束后24 h取左上叶肺组织做HE染色观察肺组织炎症改变；收集肺泡灌洗液进行细胞计数和分类；用免疫组化和West blot方法检测肺组织STAT1和STAT6的表达；用逆转录聚合酶链反应半定量检测肺组织STAT1, STAT6, IL4, eotaxin和IFNγ mRNA表达水平. 结果： ① HE染色示地塞米松组和咪喹莫特组小鼠肺组织炎症程度较哮喘小鼠减轻. ② 哮喘组小鼠BALF中细胞总数及各种炎症细胞较正常组显著增加，咪喹莫特组嗜酸性粒细胞、淋巴细胞比哮喘组明显减少(P<0.01). ③ STAT1和STAT6均在气道上皮细胞表达，哮喘组肺组织STAT1和STAT6表达较正常组增强，咪喹莫特组STAT1表达与哮喘组无明显区别，较正常组增加. ④ 哮喘组小鼠肺组织STAT1, STAT6, eotaxin, IL4 mRNA表达较正常组增强(P<0.01), IFNγ mRNA表达减少，咪喹莫特组STAT1 mRNA表达与哮喘组无明显区别，STAT6, eotaxin和IL4 mRNA的表达较哮喘组降低，较正常组增加,IFNγ mRNA表达较哮喘组增加，但低于正常组. 结论： 雾化吸入咪喹莫特可在一定程度上减轻哮喘小鼠的气道炎症，抑制肺组织STAT6蛋白和mRNA的过度表达.
【关键词】 哮喘；信号转导与转录激活因子1；信号转导与转录激活因子6；咪喹莫特
0引言
哮喘是一种由嗜酸性粒细胞，淋巴细胞以及肥大细胞等多种炎症细胞参与的复杂气道炎症性疾病，在这一炎症反应过程中T细胞是重要的启动与调节细胞. 目前多项研究表明，哮喘是一种Th2型细胞优势反应的疾病，表现为Th2型细胞因子的表达增多. 而转录信号转导子和激活子（STAT）的激活，是细胞因子发挥生物学作用的重要环节. STAT6缺乏的小鼠无法诱发气道高反应性和嗜酸性粒细胞性气道炎症［1-2］，研究证实气道高反应性的发生需要IL4介导的信号传导通路和信号分子STAT6的参与［3］. 咪喹莫特是一种免疫调节剂，它能促进培养的T淋巴细胞产生IL12和IFNγ，抑制IL4和IL5的表达［4］，使原始Th细胞向Th1细胞分化，提示咪喹莫特可能对治疗以Th2反应为主的支气管哮喘有效. 鉴于IL4及其信号传导通路中STAT6的重要作用，我们拟通过哮喘小鼠模型，研究咪喹莫特对IL4及STAT6的影响，并以糖皮质激素作对照比较，探讨其能否改善哮喘气道炎症及可能的机制.
1材料和方法
1.1材料
6 wk龄清洁级雄性Balb/c纯系小鼠40只，体质量20～25 g，购自上海实验动物中心，南京医科大学动物中心饲养（环境温度25℃，湿度70%）. 聚合酶链反应（PCR）热循环仪（PTC200 MJ research Inc），勃林格殷格翰超声雾化器，BIORAD电泳和湿转仪，低温高速离心机（eppendorf centrifuge 5810R），兔抗小鼠STAT1和STAT6多克隆抗体（美国Cell Signaling公司），OneStep RTPCR试剂盒（美国Clotech公司）, SP试剂盒（北京中山公司），Trizol（ Invivogen公司），卵白蛋白（OVA）: Ⅱ级（美国Sigma公司）. 小鼠STAT1引物序列: 上游5′TGGGAGCACGCTGCCTATGATGTC3′,下游5′CCTTCGCTTCCACTCCACGAGCTC3′；STAT6引物序列： 上游5′TCTCCACGAGCTTCACATTG3′,下游5′CTGAGGCTGTTGTCGTTGAA3′；IL4引物序列5′CAGAGCTATTGATGGGTCTC3′,下游5′TTCCAGGAAGTCTTTCA
GTG3′；IFNγ引物序列5′GGATATCTGGAGGAACTGGC3′,下游5′TTCCAGGAAGTCTTTCAGTG3′；Eot
axin引物序列: 上游5′AGAGCTCCACAGCGCTTCTATT3′,下游5′GGTGCATCTGTTGTTGGTGATT3′；GAPDH引物序列： 上游5′AGTATGACTCCACTCAC
GGCAA3′,下游5′TCTCGCTCCTGGAAGATGGT3′. 由上海博亚生物技术有限公司合成. PCR产物图像分析软件为GelPro Analyzer.
1.2方法
1.2.1小鼠哮喘模型制作与分组采用随机表法将小鼠随机等分成4组，每组10只. 哮喘组： 小鼠ip 0.1 mL致敏液（含OVA 100 μg，氢氧化铝凝胶400 μg），7 d后再以相同的剂量和方法重复致敏1次，14 d后以10 g/L OVA溶液超声雾化激发，每日30 min，连续7 d. 地塞米松组在雾化吸入前30 min按2 mg/kg, ip地塞米松溶液. 咪喹莫特组在雾化吸入前30 min预先吸入1.5 g/L咪喹莫特混悬液30 min. 正常对照组： 小鼠第1和第7 日 ip生理盐水0.1 mL, 14 d后以生理盐水溶液超声雾化，每天30 min，连续7 d.
1.2.2支气管肺泡灌洗（BAL）及BALF细胞分离与计数4组小鼠眼球摘除采血后，在环状软骨上用血管钳固定气管，其下作横行切口，置入连接注射器的硅胶管，分3次缓慢注入生理盐水，每次注入量为0.4 mL,每次灌洗后立即回收置于离心管中，计量，于-4℃储存，2 h内作细胞分离. BALF于1500 r/min离心10 min，细胞沉淀用0.5 mL PBS液重悬，取0.1 mL于血细胞计数台测定细胞总数，取0.2 mL涂片，WrightGiemsa染色，至少计数200个细胞作细胞分类计数.
1.2.3小鼠肺组织病理改变及STAT1, STAT6蛋白的表达4组小鼠末次激发后24 h开胸，取左上叶肺组织，40 g/L中性福尔马林固定20 h，石腊切片后进行HE染色，显微镜下观察肺组织的炎症改变. 免疫组织化学方法检测肺组织STAT1和STAT6表达检测步骤按SP说明书进行，显微镜下观察组织着色情况，细胞质被染成棕黄色为阳性. West blot方法检测肺组织STAT1和STAT6的表达用组织裂解液提取小鼠右肺总蛋白，取50 μg蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳分离，将分离的蛋白转到PVDF膜上，50 g/L小牛血清常温封闭1 h，1∶1000多克隆一抗4℃摇床上振荡过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶250羊抗兔IgG）常温孵育1 h，二氨基苯联胺（DAB）显色10～30 min. 结果扫描存入机，用Gelpro analyzer 软件对STAT1, STAT6蛋白表达水平进行分析.
1.2.4小鼠肺组织IL4, IFNγ, STAT1和STAT6 mRNA表达的检测4组小鼠末次激发后24 h，开胸，取右侧肺组织，置于DEPC处理高压灭菌过的冻存管中，70℃保存，待提取总RNA进行RTPCR. 肺组织RNA提取按Trizol说明书进行操作，STAT1, STAT6, GAPDH, Eotaxin RTPCR条件如下： 50℃ RT 1 h, 94℃ 5 min终止RT反应的同时进行扩增预变性，94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 68℃延伸1 min，循环35次，最后68℃延伸2 min. IFNγ退火温度58℃, IL4退火温度62℃，其余条件与STAT1相同. PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶上，在100 V/cm电压下电泳30 min，立即置于紫外线透射检测仪下观察，扫描输入机，然后使用Gelpro analyzer 软件进行光密度测量，STAT1, STAT6, IFNγ, Eotaxin和IL4条带的光密度值分别与GAPDH条带的光密度值进行比较，以其比值表示STAT1, STAT6, IFNγ, Eotaxin和IL4 mRNA表达的相对强度.
统计学处理: 采用统计学软件SPSS 11.0统计学软件，对样本先行方差齐性检验，方差齐时用 OneWay ANOVA检验. 方差不齐时，用KruskalWallis H test比较总的差异, 再用MannWhitney U进行两组之间比较. P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1肺组织病理变化正常小鼠气道上皮平整，无纤毛脱落，肺泡腔内未见炎性渗出，黏膜下未见炎细胞浸润，气管平滑肌无增厚. 哮喘小鼠HE染色可见气道上皮不完整，粘膜下有大量的炎细胞浸润，以淋巴细胞为主. 地塞米松组和咪喹莫特组炎症程度减轻.
2.2BALF中细胞计数与分类哮喘组小鼠BALF中细胞总数及各种炎症细胞较正常组增加（P<0.01），哮喘组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞主要由巨噬细胞和嗜酸性粒细胞组成(表1). 咪喹莫特组嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞比哮喘组明显减少（P<0.01）.表14组小鼠BALF总细胞数及细胞分类(略)
2.3肺组织STAT1, STAT6蛋白的表达STAT1和STAT6（图14）均在气道上皮细胞表达. 哮喘组小鼠肺组织浸润的炎症细胞和肺泡巨噬细胞上也有STAT1表达. West blot结果显示哮喘组STAT1和STAT6表达明显高于正常（P<0.01），经咪喹莫特干预后，STAT6表达减少（P<0.05），但STAT1表达与哮喘组无明显区别. 地塞米松能抑制两种转录因子的表达（P<0.01,表2）.表2四组小鼠肺组织STAT1和STAT6蛋白的表达(略)
2.4肺组织STAT1, STAT6, IL4, Eotaxin和IFNγ mRNA的表达各小鼠肺组织STAT1, STAT6, IL4, Eotaxin和IFNγ mRNA表达强度见图A: 哮喘组;B: 咪喹莫特组.表3四组小鼠肺组织STAT1, STAT6, IL4和IFNγ mRNA表达的相对强度（略）
3讨论
本结果显示，哮喘小鼠肺组织炎症细胞浸润，气道上皮呈嵴状增生或部分脱落；支气管肺泡灌洗中大量炎细胞浸润，各种细胞如单核巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞均明显增加，提示模型制备是成功和稳定的. 哮喘小鼠IL4, Eotaxin和STAT6 mRNA表达较正常小鼠增加，从而进一步证实IL4/STAT6信号传导途径在哮喘的发病机制中起重要作用，IL4激活STAT6，活化的STAT6形成二聚体由胞质进入核内，与目的基因的启动子区域结合，激活相应基因的转录与表达. 目前发现STAT6的目的基因包括Eotaxin, IL5, IL4和IL13等［4-5］，它们表达增加后反过来促进IL4表达和STAT6活化，形成炎症级联反应，导致气道炎症和气道高反应的发生和. Goldman等［6］研究发现，用IL4和IL13刺激培养的上皮细胞、内皮细胞和纤维母细胞后，不仅能检测到活化的STAT6，活化的STAT1的表达也大大增加. 我们也发现肺组织STAT1蛋白和mRNA表达较正常组增加，STAT1可增加其目的基因ICAM1表达，促进炎性细胞从血管内募集到炎症部位.
咪喹莫特是一种免疫调节剂，它由单核细胞、巨噬细胞、B细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞识别，通过与这些细胞表面受体如Toll receptor 7(TLR7)结合，诱导产生前炎症细胞因子IFNα, TNFα和IL12，这些局部产生的细胞因子促使Th1反应优势的产生［7］. 体外实验证实它还能促进培养的T淋巴细胞产生IL12和IFNγ，抑制IL4和IL5［4］，使原始Th细胞向Th1细胞分化，提示咪喹莫特可能对治疗以Th2反应为主的支气管哮喘有效. 我们以前的研究表明雾化吸入咪喹莫特能减轻哮喘大鼠的炎症反应，咪喹莫特治疗组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL4和IL5水平较哮喘组降低，IFNγ水平增高［8］.
本结果显示，咪喹莫特组小鼠肺组织STAT6、Eotaxin 和IL4表达较哮喘组减少，提示其可以抑制Th2细胞表达IL4,并降低STAT6的活性. IFNγ mRNA表达较哮喘组增加，有利于Th1优势的形成. 组织病提示咪喹莫特组小鼠气道周围炎细胞浸润及气道上皮组织增生较哮喘组明显减轻，BALF中嗜酸性粒细胞，淋巴细胞和中性粒细胞数量较哮喘组显著下降，提示该药可在一定程度上控制哮喘气道炎症. 可能的机制为： ① 通过下调IL4, STAT6的表达抑制Th2反应；② 增加IFNγ表达，促进Th1反应；③ 降低Eotaxin表达，使嗜酸性粒细胞、肥大细胞及Th2细胞趋化到炎症部位受阻. 以往有研究发现，咪喹莫特处理STAT1/小鼠，循环IFN水平下降32倍，提示STAT1在咪喹莫特引起的基因活化机制中占重要作用［9］. 而本研究发现咪喹莫特对哮喘小鼠肺组织STAT1蛋白和mRNA表达无明显影响，推测其主要通过抑制IL4/STAT6传导通路来减轻气道炎症. 而地塞米松可能通过抑制STAT1, STAT6和IL4的表达来实现这一目的.
咪喹莫特作为一种干扰素诱导新型免疫调节剂目前主要用于治疗皮肤性疾病，由于它能诱导IFNγ,抑制IL4的产生，抑制IL4/STAT6信号传导通路,使T淋巴细胞分化偏离Th2反应方向，能在一定程度上减轻哮喘的气道炎症.
【】
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