食管癌组织中S期激酶相关蛋白2mRNA的表达意义
【关键词】 食管肿瘤
Significance of Sphase kinaseassociated protein 2mRNA expression in esophageal carcinoma
【Abstract】 AIM: To explore the Sphase kinaseassociated protein 2mRNA expression and its relationship with clinical pathologic characteristics in esophageal cancer. METHODS: The expression of Skp2mRNA in esophageal carcinoma tissues and its corresponding adjacent tissues was detected by RTPCR in 45 patients. RESULTS: The positive incidence of Skp2mRNA expression in esophageal carcinoma was 66.6%, while in its corresponding adjacent tissues was 24.4%. The expression of Skp2mRNA was correlated with the degree of differentiation and TNM stage of carcinoma, but not correlated with patients age, gender, tumor size, and lymph node metastasis. CONCLUSION: Increased Skp2mRNA expression contributes to the carcinogenesis and progress of esophageal carcinoma, which may provide some new ways in the early diagnosis and therapy for esophageal carcinoma.
【Keywords】 Sphase kinaseassociated proteins; reverse transcriptase polymerase chain reaction; esophageal neoplasms
【摘要】 目的： 探讨S期激酶相关蛋白2mRNA在食管癌及其癌旁组织中的表达及其与食管癌临床病理特征的关系. 方法： 采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测S期激酶相关蛋白2mRNA在45例手术切除的食管癌组织及癌旁组织中的表达. 结果： S期激酶相关蛋白2mRNA表达率在食管癌中为66.6%(30/45) ,而癌旁组织中为24.4%(11/45) ,差异有显著性(P<0.05). S期激酶相关蛋白2mRNA阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤大小、及有无淋巴结转移无关,与肿瘤分化程度及TNM分期有关(P<0.05). 结论: S期激酶相关蛋白2的高水平表达促进了食管癌的发生.并将可能为食管癌的早期诊断和提供新的手段.
【关键词】 S期激酶相关蛋白质类;逆转录聚合酶链反应；食管肿瘤
0引言
我国是食管癌高发区,在我国居恶性肿瘤的第四位［1］. Skp2(Sphase kinaseassociated protein 2) 是新发现的SCF（Skp1CullinFbox)多功能E3酶复合体中的一种Fbox蛋白，参与细胞增殖与调亡的调控，与肿瘤的发生发展有着密切的关系. 我们利用RTPCR法检测中手术切除的食管癌标本S期激酶相关蛋白2mRNA表达,探讨其与食管癌临床病理参数之间的关系.
1材料和方法
1.1材料
45例食管癌来自第三军医大学第一附属(2004～2005)手术标本，由西南医院病理科经病理证实为食管癌，全部病例术前均未作化疗、放疗;其中男28例,女17例. 年龄25～70（平均50.2）岁. 取癌组织及手术切缘组织,放入经二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理过的Ep管内,置-70℃低温冰箱保存备用.TriPure分离试剂(Roche);RTPCR试剂盒(博大泰克公司); S期激酶相关蛋白2引物及βactin引物(上海生工合成);PCR markerⅠ(北京天为时代). 紫外分光光度计(DU640型,美国) ,PCR扩增仪(2700型,PE公司,美国).ZF90型多功能暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂),凝胶成像仪(BioRad公司,美国).
1.2方法
采用TriPure一步法提取组织总RNA,操作方法按试剂说明进行. 将提取的总RNA用DEPC处理过的去离子水重悬RNA颗粒,紫外分光光度计(BioRad)下进行核酸定量. RTPCR检测食管癌及癌旁组织中S期激酶相关蛋白2mRNA的表达采用两步法试剂盒(博大泰克公司). S期激酶相关蛋白2与βactin引物序列根据电脑软件Primer5.0版设计,其上游序列: 5′ACC TTT CTG GGT GTT CTG GAT T3′;下游序列: 5′GAT AGG TGT TGG AGG TAG TTG AGC3′. PCR产物片段为316 bp. 以βactin为内参照,其上游引物序列: 5′GAA ACT ACC TTC AAC TCC ATC3′; 下游引物序列: 5′CAT CTC TTG CTC GAA GTC3′. PCR产物片段为502 bp. RTPCR的操作步骤参照试剂盒说明进行. 先将以上所提取的总RNA反转录成cDNA. PCR扩增反应: 取2 μL反转录cDNA PCR扩增,反应体积为50 μL, 并按以下参数在PCR扩增仪(2700型,PE公司,美国) 上进行: 94℃预变性5 min, 94℃变性50 s, 53℃退火50 s, 72℃延伸2 min, 40个循环;72℃最终延伸8 min, 4℃贮存备用. 取5 μL PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后,紫外透射仪下观察结果,并在凝胶成像仪上照相. 以PCRMaker为标准,在316 bp位置出现条带为Skp2表达阳性. 而βactin在502 bp位置上出现条带为表达阳性.
统计学处理: 采用SPSS10.0软件进行χ2检验分析. P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1S期激酶相关蛋白2mRNA的检出率45患者中有30例食管癌组织S期激酶相关蛋白2mRNA阳性表达,总阳性率为66.6%. 癌旁组织中有11例(24.4%) 表达为阳性或弱阳性. 两者具有统计学差异(P<0.05，表1，图1）.表1Skp2mRNA在癌组织与癌旁组织表达的关系（略）
2.2S期激酶相关蛋白2mRNA表达与临床病理S期激酶相关蛋白2mRNA阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤大小、及有无淋巴结转移无关,与肿瘤分化程度及TNM分期有关(P<0.05，表2).表2S期激酶相关蛋白2mRNA表达与食管癌临床病理参数的关系(略)
3讨论
S期激酶相关蛋白2是新发现的SCF多功能E3酶复合体中的一种Fbox蛋白. Zhang等［2］1995年从人成纤维细胞中首次克隆Skp2(p45)，发现胞内注射p45抗体或反义寡核酸能阻断p45的功能，阻止细胞进入S期,认为p45增加与转化细胞的细胞周期控制改变有关，p45因与细胞周期蛋白Cyclin A相互作用而命名Skp2. Skp2基因定位于人5号染色体短臂上(5p13).
泛素蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome pathway) 是真核细胞中的一种蛋白降解途径,主要降解胞内泛素化的蛋白质［3］. 泛素经过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2 及泛素连接酶E3等一系列催化步骤结合底物蛋白,形成泛素底物蛋白复合体,使底物进入26S蛋白酶体内实现泛素化降解. 泛素连接酶复合物SCF的Fbox亚基能特异性识别底物并与之结合,使之进入泛素化降解. Skp2则是Fbox蛋白家庭成员之一. Skp2在许多细胞周期相关蛋白的泛素依赖性蛋白水解途径中起着特异性的识别底物的作用，参与细胞增殖与调亡的调控，与肿瘤的发生有着密切的关系［4-5］.
本研究发现, Skp2mRNA在食管癌中存在Skp2基因表达的增高，从转录水平上证明了Skp2基因与食管癌的发生有关. Skp2mRNA阳性表达率与食管癌患者年龄、性别、肿瘤大小、有无淋巴结转移无关（P>0.05）;与食管癌分化程度及TNM分期有关. 我们研究表明，kp2作为泛素蛋白酶体途径的底物识别序列,参与调控细胞周期，促进了食管癌的发生发展，可为食管癌的早期诊断和提供新的手段.
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［1］ Liu JF, Wang QZ, Hou J. Surgical treatment for cancer of the oesophagus and gastric cardia in Hebei, China ［J］. Br J Surg, 2004,91:90-98.
［2］ Zhang H, Kobayashi R, Galaktionv K, et al. p19skp1 and p45skp2 are essential elements of the cyclin ACDK2 S phase Kinase ［J］. Cell, 1995,82(6):915-925.
［3］ Lima CD. Bridging the Gap between SCF and ubiquitin transfer ［J］. Structure,2002,6（10）:741-742.
［4］ Yamasaki L, Pagano M. Cell cycle, proteolysis and cancer ［J］. Current Opinion in Cell Biology, 2004,6(16):623-628.
［5］ Lin DI. Diehl JA. Mechanism of cellcycle control: Ligating the ligase ［J］. Trends Biochem Sci, 2004,9(29):453-455.
