大鼠下丘脑星形胶质细胞对不同时段睡眠剥夺的反应
【关键词】 下丘脑
Response of astrocytes in rat hypothalamus to sleep deprivation of different time period
【Abstract】 AIM: To explore the response of astrocytes in rat hypothalamus to sleep deprivation of different time period. METHODS: Fortyfive male SD rats were randomly divided into 3 groups and then in each group, 7 rats were deprived of sleep for 3, 6, 12, 24, 48, 72 and 96 h respectively by housing them on the small platforms over water（SD）, another 7 rats on the large platforms（TC）and 1 rat in the normal cage（CC）. The number of rats receiving the same treatment was 3. The changes of the glial fibrillary acidic protein（GFAP）expression induced by SD were detected by immunohistochemistry. RESULTS: The expression of GFAP in hypothalamic nuclei changed along with the time lengths of SD. The expressions of GFAP in suprachiasmatic nucleus （SCN） and in paraventricular nucleus（Pa） reached the peaks after 24 h SD, in arcuate nucleus（Arc） after 48 h SD and in supraoptic nucleus（SO） they increased as soon as SD began and reached the peaks 24 h later. CONCLUSION: It is possible that astrocytes participate in the regulation of biologic rhythm of hypothalamic nucleus.
【Keywords】 sleep deprivation; hypothalamus; astrocytes; glial fibrillary acidic protein; rats
【摘要】 目的： 探索不同时段睡眠剥夺后大鼠下丘脑内星形胶质细胞的反应. 方法： 雄性大鼠45只随机分为3组，每组内再分3组： 睡眠剥夺组7只, 采用小环境水平台法建立大鼠睡眠剥夺模型，分别剥夺睡眠3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 h；与其对应的大平台对照组7只；正常单独笼养组1只. 接受同一处理的大鼠各有3只. 用免疫组化的方法检测胶原纤维酸性蛋白（GFAP）在下丘脑的表达变化. 结果: GFAP在下丘脑核群的表达出现随睡眠剥夺时间长短变化的趋势，在交叉上核和室旁核的表达于24 h达在高峰后下降，在弓状核的表达于48 h达高峰，在视上核的表达开始即上升，24 h达高峰后下降. 结论： 星形胶质细胞可能参与下丘脑核团的生物节律调节.
【关键词】睡眠剥夺；下丘脑；星形细胞；神经胶质原纤维酸性蛋白质；大鼠
0引言
下丘脑被认为是睡眠觉醒节律的中枢发生部位，与神经系统其他部位存在广泛的联系，它作为神经内分泌中心又调控着某些激素的分泌节律. 睡眠剥夺（sleep deprivation, SD）即限制受试者的睡眠时间至正常需要量以下. 近年来SD对机体的影响备受人关注，但关于SD与神经胶质细胞关系的研究很少. 本研究采用免疫组织化学的方法，观察不同时段SD后下丘脑内GFAP的改变，探讨星形胶质细胞（astrocyte, AS）对SD的反应以及其在睡眠调节中的作用.
1材料和方法
1.1材料
成年、雄性、健康上海产SpragueDawley大鼠45只，体质量（180±10） g，由第四军医大学实验动物中心提供. 将45只大鼠随机分为3组，每组15只又随机分为小平台实验组（sleep deprivation group, SD组）7只，大平台对照组（tank control group, TC组）7只及单独笼养的空白对照组（cage control group, CC组）一只；SD与TC各组内7只大鼠分别随机进行3, 6, 12, 24, 48, 72和96 h睡眠剥夺处理. 睡眠剥夺模型的建立，采用小平台水环境法［1］（flower pot）建立大鼠SD模型.
1.2方法
1.2.1脑组织标本采集各组大鼠到实验时间点后立即腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，开胸经升主动脉灌注生理盐水100 mL快速冲洗全身组织血液，随后灌注冷的（4℃） 40 g/L多聚甲醛（pH 7.4）500 mL，先快后慢持续60~90 min. 灌注结束后取全脑置于200 g/L蔗糖磷酸缓冲液（pH 7.4）中，4℃冰箱保存至组织块沉底. 用恒冷箱切片机做连续冠状冰冻切片，片厚30 μm，隔5取1，切片收集于0.01 mol/L PBS中.
1.2.2免疫组织化学染色切片分为2组： 第1组： 抗GFAP免疫组化反应（ABC法）： 室温下，切片用3 g/L TritonX100液孵育30 min；入兔抗GFAP抗体稀释液（1∶3000, Sigma）孵育24 h；生物素标记的羊抗兔IgG（1∶500, Sigma）孵育2h；生物素卵白素HRP复合物，ABC（1∶500, Sigma）孵育2h；最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法显色. 以上每一步骤之后均用0.01 mol/L PBS充分漂洗3次，每次10 min；DAB显色前后各用蒸馏水快速冲洗脑片3次. 第2组： 用PBS替代GFAP抗体，再按ABC法进行免疫组化染色，结果为阴性.
1.2.3结果判定主要采用显微镜下计数下丘脑各核团GFAP阳性细胞的数量并结合细胞形态的改变如细胞深染、胞体变大和突起变粗来判定. 具体判断标准： 60为极强阳性(), 40~59为强阳性(), 20~39为阳性(), 5~19为(＋), <5个为阴性（-）.
2结果
SD组在实验后，GFAP在下丘脑各个核团的表达均出现随SD时段变化的趋势（图1）. GFAP在交叉上核的表达在SD 12~24 h达到高峰，以后又降低；在弓状核的表达于48 h时最强；在视上核的表达于开始即增强，24 h时达高峰，48 h后又减弱；在室旁核的表达于24 h时略增强. TC组GFAP在各核团的阳性表达也略微增强，但未见明显随时间变化的趋势（表1）.表1不同时段SD各组大鼠下丘脑核群GFAP的表达强度（略）
3讨论
下丘脑是较高级的调节内脏活动的中枢，调节体温、营养摄取、水平衡、内分泌、情绪反应、生物节律等生理过程. 视交叉上核是日周期节律的控制中心，摘除双眼而处于自由行走的大鼠，其睡眠白昼多于夜间的节律仍然存在，如再破坏其视交叉上核，这种日周期节律则完全丧失［2］. 在体或离体实验均已证实，视交叉上核神经元放电活动呈现周期约为24h的昼夜节律性［3］. 本实验观察到，SD后第1日，视交叉上核GFAP表达增强（特别是SD 12~24 h），以后又减弱，这表明在SD 12 h后大鼠视交叉上核的AS被激活，A: 24 h SD组视交叉上核；B: 24 h TC组视交叉上核；C: 48 h SD组弓状核；D: 48 h TC组弓状核；E: 24 h SD组视上核；F: 24 h TC组视上核；G: 24 h SD组室旁核；H: 24 h TC组室旁核.
SD 24 h为一个完整的日周期生物节律紊乱，AS表达最高；SD 24~96 h, GFAP表达降低，可认为大鼠视交叉上核对SD后的生物钟节律的重新调整. 我们研究表明，AS参与睡眠调节［4-5］，SD使动物生物节律改变［6］，这此与报道基本一致. 弓状核接受中缝核内5HT能神经元的部分纤维投射［7］，5HT能神经元的胞体主要集中在中缝核群，中缝核吻侧5HT递质系统受中脑网状激动系统的驱动，涉及睡眠的发生和慢波睡眠的维持，SD可增加中缝核5HT能神经元阳性率，使该系统活动增强，而后者又可反馈抑制网状激动系统的作用［8］. 另外我们在SD后亦发现脑干中缝核的GFAP阳性表达以及随时间变化的性［4］，说明在下丘脑和脑干中缝核之间的联系参与SD后的一系列生理反应. 本实验中弓状核在SD 48h时GFAP表达最强而后减弱的现象，说明下丘脑弓状核接受脑干中缝核投射纤维后，AS激活并参与对睡眠节律的调节. 视上核主分泌垂体加压素，对血压和渗透压的调节发挥重要作用［9］. 实验中视上核GFAP表达在SD一开始即升高，24 h达高峰而后降低，说明SD作为一种应激原，视上核AS参与了应激反应. 室旁核不仅与视上核通过分泌抗利尿激素调节机体水平衡而且含有许多促肾上腺皮质激素释放激素神经元，因此它既有神经内分泌功能，又有典型的神经调节作用［10］. 实验中AS在室旁核的表达于24 h时略增强，可认为是对内环境稳态变化的反应.
尽管有些下丘脑核团在TC组GFAP表达也有所增强，但未表现出与SD组相似的随时间变化的趋势，可认为由于活动限制及隔离使大鼠的神经内分泌调节轻微改变所致. 从本实验结果可以看出，不同时段SD对大鼠下丘脑核群AS的表达存在不同影响，故认为AS可能参与下丘脑核团生物节律的调节. 但AS是以哪种方式参与睡眠调节的呢？SD后AS以哪种途径与神经元进行信息交流呢？具体机制有待进一步研究.
【文献】
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