Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

          作者：季国忠，张发明，翟惠虹，范志宁，樊代明，王学浩

【关键词】  慢病毒

    Construction and identification of lentiviral vector of RNA interference of Smad4 gene

　　【Abstract】 AIM: To construct a lentiviral vector of RNA interference (RNAi) of Smad4 gene. METHODS: The effective sequence of siRNA targeting Smad4 gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed, synthesized and cloned into the pLVTHM vector, which contained H1 promoter and green fluorescent protein (GFP). The resulting lentiviral vector containing Smad4 shRNA was named LVshSmad4, and it was confirmed by PCR and sequencing. 293T cells were cotransfected with lentiviral vector LVshSmad4，pCMVdR8.74 and pMD2G. All virus stocks were produced by calcium phosphatemediated transfection. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. RESULTS: PCR and DNA sequencing demonstrated that the lentivirus RNAi vector of Smad4 (LVshSmad4) producing Smad4 shRNA was constructed successfully. The titer of concentrated virus was 5×1010 pfu/L. CONCLUSION: The lentivirus RNAi vector of Smad4 was constructed successfully.

　　【Keywords】 RNA interference; Smad4; Neoplasms; Lentivirus

　　【摘要】 目的：构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法：针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体［含H1启动子和绿色荧光蛋白（GFP）］连接产生LVshSmad4慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定. 用LVshSmad4，pCMVdR8.74和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度. 结果：PCR和测序证实，成功构建Smad4 shRNA的慢病毒载体LVshSmad4. 包装慢病毒，浓缩病毒悬液的滴度为5×1010 pfu/L. 结论：成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体.

　　【关键词】 RNA干扰；Smad4；肿瘤；慢病毒

　　0引言

　　转化生长因子β(TGFβ)Smad信号途径在肿瘤发生机制中发挥重要作用. Smad4（deleted in pancreatic carcinoma locus 4, DPC4）在信号传输途径中处于中枢地位，活化的RSmads与Smad4结合成寡聚物，将TGFβ的信号传递到核内，调节靶基因的转录并诱导下游基因的表达［1］. 近年来，RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术的出现，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具. 我们在已经获取Smad4基因的RNAi有效靶序列的基础上，设计、构建和鉴定表达Smad4 siRNA的慢病毒载体，为后期研究Smad4基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因打下基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料采用慢病毒的包装细胞293T细胞株（中科院上海细胞所）、大肠杆菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（Invotrogen公司）. 慢病毒载体系统（Tronolab公司www.tronolab.com/lentivectors.php）. 该病毒包装系统由pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G 3质粒组成，其中pLVTHM含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达绿色荧光蛋白（GFP）. pCMVdR8.74和pMD2G含有病毒包装所必须的元件. 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、大量质粒DNA提取试剂盒（Qiagen公司).

　　1.2方法

　　1.2.1构建表达shRNA慢病毒载体用Ambion公司的设计软件，设计、合成3对针对Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列. 经分别构建质粒，转染293细胞，据其对Smad4的抑制率，确定有效靶序列：5′GTACTTCATACCATGCCGA3′，（Smad4 mRNA第1848位，GenBank gi：34147555）. 设计并合成（上海吉凯基因化学技术公司）其shRNA的DNA Oligo：5′CGCGTCCCCGTACTTCATACCATGCCGATTCAAGAGA
TCGGCATGGTATGAAGTACTTTTTGGAAAT3′（内含MluI和ClaI酶切位点，下划线所示www.tronolab.com/lentivectors.php）. 经退火形成双链DNA，与经MluI和ClaI双酶切后的pLVTHM载体连接，转化DH5大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行PCR及测序鉴定（上海博亚生物技术有限公司）. PCR鉴定阳性克隆的primer: Up: 5′GTGTCACTAGGCGGGAACAC3′；Down: 5′TTATTCCCATGCGACGGTATC3′.

　　1.2.2慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为0.5×109/L时，重新接种于25 mL的细胞培养皿，37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养，细胞密度达60%～70%时转染. 制备慢病毒包装系统中3种质粒DNA溶液（LVshSmad4 20 μg，pCMVdR8.74 15 μg，pMD2G 7.5 μg），无菌水定容至1800 μL, 再加入CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混匀，加入2×缓冲盐溶液2000 μL，室温放置20～30 min. 将DNA磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15 mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次. 然后每瓶细胞中加入含100 mL/L小牛血清的细胞培养液15 mL，继续培养48 h. 收集转染72 h的293T细胞上清液. 于4℃，4000 g离心10 min；以0.45 μm滤器过滤后置于40 mL超速离心管中，4℃，25 000 r/min离心20 min；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4℃溶解过夜. 次日，以10 μL每管分装病毒液置于-70℃冰箱中保存. DMEM培养液重悬293T细胞至5×108/L, 在96孔板每孔中加100 μL重悬细胞.  取6个eppendorf管，每管中加入90 μL预热的OptiMEM培养基, 加10 μL病毒颗粒于第1管，混匀，从第1管取10 μL混合液于下一管，混匀；依次稀释病毒颗粒至第6管；将96孔板中培养基吸出，每孔加45 μL病毒颗粒稀释液，37℃温育8 h后，更换含100 mL/L FBS的培养液继续培养. 倒置荧光显微镜下检测GFP表达量，病毒滴度.

　　2结果

　　2．1阳性克隆的PCR鉴定Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列，经退火形成双链DNA，与经MluI和ClaI双酶切后的pLVTHM载体连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑取重组阳性克隆，行PCR鉴定阳性克隆. 重组细菌克隆的PCR产物277 bp（插入片段为67 bp），以经双酶切后没有插入片段的pLVTHM空载体PCR产物210 bp为对照（图1），鉴定结果与预期相符. 测序结果表明合成的Smad4 shRNA寡核苷酸链序列插入正确（123~189），此时命名慢病毒重组载体为LVshSmad4(图2).

　　M：Marker；1：对照；2：重组细菌克隆的PCR产物.

　　图1PCR鉴定阳性克隆（略）

　　2．2慢病毒载体的包装及滴度测定提取获得500 μg重组质粒. 将慢病毒包装系统中3种质粒共转染293T细胞，在倒置显微镜下观察各孔中GFP的表达量，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数. 测定滴度为5×1010 pfu/L，说明有大量质粒转入293T细胞，病毒成功包装.

　　3讨论

　　近年来TGFβSmad信号通路在恶性肿瘤中的研究是肿瘤信号转导领域的一大热点［1］. Smad4扮演抑癌基因的作用［2-4］. 利用Smad4在TGFβSmad通路中的处于中枢环节的机制，沉默敲除或者恢复Smad4，再研究其下游调节基因表达变化和生物学特性的改变，是倍受重视的研究思路［1］. RNAi技术的出现，成了一种新的反向遗传学手段被广泛地应用于基因功能分析、信号转导通路研究和基因. 质粒介导RNAi有一定的局限性，转染率低，基因抑制表达作用弱，持续时间短［2-5］，不适合体内实验. 慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，以HIV1为基础而得，具有许多优点，能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞，而且病毒的遗传物质能够整合到宿主的基因组，将其用于肿瘤的基因治疗，除比其他病毒载体更具优势外，病毒的VSVG外壳使载体病毒颗粒具有更强的稳定性,慢病毒载体RNAi作用持久,同时扩大了载体感染细胞的范围. 因此慢病毒载体是很有前途的基因治疗载体. 最近，用慢病毒载体介导RNAi的几项体内外研究［6-8］即显示了该技术策略在内源性基因功能研究和基因治疗前沿领域的重大意义.

　　基于目前尚无将RNAi技术应用于肝细胞癌Smad4的研究报道, 我们在筛选出Smad4基因RNAi的有效靶序列后，构建表达shRNA慢病毒载体，以进一步研究沉默Smad4基因对肝癌细胞生物学行为的影响并探讨其机制. 为构建Smad4 shRNA慢病毒载体，购买了病毒包装系统pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G质粒. 其中，pLVTHM质粒中含有H1启动子，能在宿主细胞中持续表达siRNA，同时该质粒能表达由EF1（Elongation Factor）启动子驱动的GFP，可用于病毒包装时转染效率及感染目的细胞的感染效率的检测. pCMVdR8.74质粒中含有HIV病毒的Gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；Pol基因，编码病毒特异性的酶；Rev基因，编码调节Gag和Pol基因表达的调节因子. pMD2G质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白. 293T细胞是293细胞的一种，作为包装细胞，在包装后产生了高滴度的病毒颗粒，同时表达报告基因. 本结果表明，成功构建了含有GFP报告基因的Smad4基因shRNA慢病毒载体，为进一步研究Smad4基因在肿瘤中的作用机制和动物基因治疗奠定基础.

　　图2慢病毒重组载体LVshSmad4的测序结果（略）.

　　【】
　　
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