大鼠肝癌细胞表面特标记与成瘤能力有关

【关键词】  ,肝肿瘤

    Relationship between surface markers characteristic and tumorigenic ability in rat hepatocarcinoma cells

　　【Abstract】 AIM: To study the relationship between surface markers characteristic and tumorigenic ability in rat hepatocarcinoma cells. METHODS: The primary liver carcinoma in rats were induced by diethylnitrosamine. Tumor cells from 8 rats with primary liver carcinoma were separated according to rat oval cell (OVC) surface markers such as CD34, cKit, Thy1, AFP, CK7, CK8,CK14,CK18,CK19 and GGT.The tumor in nude rats which had been injected with hepatocarcinoma cells (10 OVC marker negative or positive cells ) for 1 month were weighted respectively. The subpopulations of hepatocarcinoma cells, which had a stronger ability to cause tumor after injected to nude rats, were diluted to 1/100 or 1/10 of original density. Then we analyzed the tumorigenic ability of these subpopulations in a low cell density. RESULTS: The weight of the tumors in nude rats which had been injected with the CD34, Thy1, AFP, CK7, CK8 and GGT positive subpopulations was different from that of ones with the negative subpopulations (P<0.05 or 0.01). The cell subpopulation of AFP(+) or CK7(-)  had a stronger ability to cause tumor when diluted to 1/100-1/10  of original density. CONCLUSION: Different subpopulations of the hepatocarcinoma cells had a different ability to cause tumor in rats. AFP(+) and CK7 (-) may be the markers characteristic of hepatocarcinoma stem cells.

　　【Keywords】 liver neoplasms; stem cells; surface markers

　　【摘要】 目的：研究大鼠肝癌细胞表面标记特征与成瘤能力关系. 方法：二乙基亚硝胺为诱癌剂制造大鼠肝癌模型，分离培养肿瘤细胞，按照卵圆细胞表面标记（CD34,cKit,Thy1,AFP，CK7，CK8,CK14,CK18,CK19和GGT）分选肿瘤细胞，比较各个表面标记阳性肿瘤细胞亚群与阴性肿瘤细胞亚群移植裸鼠后成瘤能力差异，并且对数稀释成瘤能力强的细胞亚群，分析低密度下强成瘤能力细胞亚群与相应阴性细胞亚群成瘤差异. 结果： CD34,Thy1,CK7,CK8,AFP和GGT等6个标记的阳性与阴性肿瘤细胞移植裸鼠后，成瘤能力差异显著(P<0.05或0.01)；1/100~1/10细胞密度的CK7阴性与AFP阳性细胞亚群成瘤能力仍然比其对应细胞亚群为高. 结论：大鼠原发性肝癌肿瘤细胞中存在成瘤能力差异巨大的肿瘤细胞亚群. CK7(-)和AFP(+)，可能是大鼠肝癌干细胞的部分表面标记特征.

　　【关键词】 肝肿瘤；干细胞；表面标记

　　0引言

　　肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSC)是近年肿瘤研究的热点. TSC来源于相应的成体干细胞，是肿瘤发生、扩散与转移的基础［1-3］. 目前肝癌干细胞的研究报道很少. 我们知道，卵圆细胞（oval cells, OVC）不仅具备基本的肝干细胞性质，而且与肝癌发生关系密切，是最接近肝癌干细胞的成体干细胞. 我们通过OVC表面标记分选肝癌肿瘤细胞，了解不同肝癌细胞亚群的裸鼠成瘤能力，探索肝癌干细胞的表面标记特征.

　　1材料和方法

　　1.1材料雄性清洁级SD大鼠8只， 8 wk大，体质量（233.8±24.5）g，雄性裸小鼠(BALB/cnu/nu)，4~6 wk，体质量15~20 g，由南方医科大学动物实验中心提供. 饲养温度22~25℃，湿度（50±5）%，在正常光照及自由摄食条件下饲养于普通饲养室，裸小鼠饲养于SPF级饲养室. RPMI 1640与胎牛血清为美国Gibco公司产品; 二乙基亚硝胺及胰蛋白酶为Sigma公司产品;一抗CD34, cKit,Thy1,AFP,CK7,CK8,CK14,CK18,CK19和GGT购自北京中杉金桥生物技术有限公司.

　　1.2方法以二乙基亚硝胺为诱癌剂，70 mg/kg加入饲料中，每周1次，室温25~28℃. 诱癌至12 wk时改喂标准饲料，共18 wk. 大鼠出现明显肝癌症状，濒临死亡时提前取标本. 大鼠诱癌成功后，无菌下取肿瘤组织约1 mm3，置于含青霉素的无菌RPMI 1640培养液中，用生理盐水漂洗2次，剪碎，放入2.5 g/L胰蛋白酶消化液. 细胞消化液经200目细胞筛过滤，用完全培养液制成单细胞悬液常规培养. 采用OVC 10个表面标记物（CD34，cKit，Thy1，AFP，CK7，CK8，CK14，CK18，CK19和GGT）作为分选肿瘤细胞的特征标记. 亲和板结合分离法分选肿瘤细胞. ①将100 μL纯化的羊抗鼠IgG加入到无菌塑料平皿中，再加缓冲液3 mL混匀，4℃过夜，次日吸弃上清液， PBS洗去多余的抗体，含10 mL/L小牛血清PBS室温下孵育，PBS洗3次，4℃保存备用. ②取肿瘤细胞，每1×106个细胞加入各OVC表面标记工作液100 μL,4℃作用1 h,培养液悬浮细胞，(1.5~2)×107个加入到上面准备好的塑料平皿中， Hanks液稀释为3 mL,轻轻摇匀，4℃ 1 h（20 min摇1次）. 取悬液中细胞标记为阴性细胞，洗脱黏附在塑料平皿的肿瘤细胞，标记为阳性细胞，继续常规培养. 调整肿瘤细胞（阳性细胞或阴性细胞）密度为5×1010／L，取0.2 mL细胞悬液注射到裸鼠腋背部皮下，观察裸鼠移植肿瘤生长情况，1 mo裸鼠移植肿瘤测质量. 对致瘤能力强的肿瘤亚群进行对数稀释（1/100或1/10）后，取0.2 mL细胞悬液注射到裸鼠腋背部皮下，1 mo测量移植肿瘤质量，了解强致瘤肿瘤细胞亚群低细胞密度下致瘤能力.

　　统计学处理：各组肝癌细胞亚群成瘤能力以肿瘤细胞移植裸鼠后形成肿瘤质量表示，均通过SPSS 10.0软件进行配对t检验. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　CD34，Thy1，CK7，CK8，AFP和GGT等6个标记的阳性与阴性肿瘤细胞移植裸鼠1 mo后，成瘤能力差异显著(P<0.05)，而按照CK7， Thy1与AFP这2个表面标记分选的肿瘤细胞亚群成瘤能力差异尤其明显（P<0.01,表1）. 将成瘤能力差异显著的阳性与阴性肿瘤细胞（CD34,Thy1,CK7,CK8,AFP和GGT）进行对数稀释，1 mo后观察发现，高致瘤亚群［CK7（-）和AFP(+)］在1/10密度接种条件下，成瘤比例保持在100%，仍然大大高于原密度接种的对应低致瘤亚群细胞［CK7（+）和AFP(-)］；甚至在1/100密度接种条件下，这2个细胞亚群仍然有一定的成瘤比例. 高致瘤亚群Thy1(+)也有较高的成瘤比例，但是较CK7（-）和AFP(+)稍弱. CD34 (+)，CK8 (+)与GGT (+)亚群对数稀释后成瘤比例大幅度下降，比对应低致瘤亚群细胞原密度接种条件下的成瘤比例低（表2）.

　　表1表面标记物分选的阳性与阴性细胞亚群的成瘤质量(略)

　　aP<0.05, bP<0.01 vs阳性细胞.

　　表2低接种密度下强致瘤亚群裸鼠成瘤比率(略)

　　3讨论

　　TSC表现为一种特殊类型的干细胞，具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化的潜能. TSC增殖过程中，通过不均一分裂，一个TSC分裂形成一个新的TSC，和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持TSC数目稳定并产生肿瘤. 大量的证据表明，TSC起源于相对应的成体干细胞［4］. OVC不仅是肝脏干细胞的子代细胞，也是肝癌发生的前体细胞. OVC经致癌剂或癌基因诱导转化后可形成肝细胞癌、胆管上皮癌和未分化癌. OVC是肝细胞癌、胆管上皮癌的祖细胞，与肝肿瘤的发生有密切的关系. 所有癌组织内显示cHaras基因表达阴性，而癌旁组织内则可见ras基因的大量表达，证实了OVC是宿主受化学致癌剂作用后发生肝癌的始动细胞［5］. 大鼠肝脏出现大量的OVC将不可避免地成肝细胞癌. OVC是肝癌前体细胞. OVC存在于人类慢性肝病的肝脏组织中，也存在于人类肝细胞癌和癌旁组织中［6］.

　　我们采用OVC的表面标记分选肝癌细胞，研究不同肝癌细胞亚群的裸鼠成瘤能力，发现存在一定的差别. 其中CD34，Thy1，CK7，CK8，AFP和GGT等6个标记的阳性与阴性肿瘤细胞移植裸鼠后，成瘤能力差异显著，而按照AFP，CK7与Thy1这3个表面标记分选的肿瘤细胞亚群成瘤能力差异尤其明显. 在1/100细胞密度下， AFP（+）与CK7（-）肿瘤细胞亚群成瘤能力仍强于对应阴性或阳性肿瘤细胞亚群，说明AFP（+）与CK7（-）肿瘤细胞亚群具备非常大的成瘤能力，具备一定的TSC特征，表明AFP（+）与CK7（-），甚至Thy1（+），是大鼠肝癌TSC的部分可能表面标记，对肝癌TSC的最终分离与鉴定具有重要的意义.

　　【】

　　［1］ Pardal R, Clarke MF, Morrison SJ. Applying the principles of stemcell biology to cancer［J］. Nat Rev Cancer,2003,3(12):895-902.

　　［2］ Behbod F, Rosen JM. Will cancer stem cells provide new therapeutic targets ［J］? Carcinogenesis, 2005，26(4):703-711.

　　［3］ Nakano I, Hemmati HD, Kornblum HI.Cancer stem cells in pediatric brain tumors［J］. No Shinkei Geka,2004，32(8):827-834.

　　［4］ AlHajj M, Becker MW, Wicha M,et al. Therapeutic implications of cancer stem cells［J］. Curr Opin Genet Dev,2004，14(1):43-47.

　　［5］ BeckerR,Luthgens B,Oesch F,et al.Haras val 12 but not p53 Ser247 leads to a significant neoplastic transformation rate of the putative rat liver stem cells (oval cell) ［J］.Carcinogenesis,1996，17(12):2635.

　　［6］ 邱德凯，马雄，彭延中，等. 慢性肝病患者肝脏卵圆细胞的定位和定量研究―29例慢性肝病患者肝组织病分析［J］.中华消化杂志,2000,20（5）：301-303.