建立SYBR Green实时RT

                                                     作者：温冬青，赵锦荣，孔亚林，郭慧芳，阎小君 

【关键词】  聚合酶链反应

    SYBR Green Ibased realtime quantitative RTPCR method for detecting mRNA level of type I collagen in rats

　　【Abstract】 AIM: To establish SYBR Green Ibased realtime quantitative RTPCR method for detecting type I collagen mRNA in rats. METHODS:  Type I collagen cDNA was amplified by RTPCR method and cloned into pMD18T vector. The recombinant plasmid was selected and identified by sequence analysis. It was then diluted pro rata as standard template. The mRNA expression of type I collagen in rats was detected using realtime quantitative RTPCR method with fluorescent DNA dye SYBR Green I. RESULTS:  The recombinant plasmid was established and confirmed as expected. The kinetics graph after realtime PCR detected even one molecule. The standard curve indicated the liner relationship between CT (cycle threshold) and template concentration. The correlation coefficient of external standard between the input copies and fluorescence intensity was 0.991. CONCLUSION:  The established method for detecting type I collagen mRNA in rats is sensitive and specific. Realtime quantitative  RTPCR based on SYBR Green I is an excellent candidate as a standard detection method for largescale application.

　　【Keywords】 gene expression；polymerase chain reaction；type I collagen；mRNA

　　【摘要】 目的： 基于双链嵌合荧光染料SYBR Green I，建立一种快速、灵敏的检测大鼠I型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法. 方法： 提取大鼠肝脏总RNA，RTPCR扩增I型胶原基因部分片段，将其克隆入pMD18T载体用作参比品. 基于SYBR Green I双链嵌合染料建立检测大鼠I型胶原mRNA表达水平方法. 其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析，评价所建立方法的检测灵敏度；对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性. 结果： 重组质粒构建成功，经测序鉴定，目的片段已插入pMD18T载体内. 所建立的实时RTPCR方法的最低检测限度为1个拷贝/反应，在每反应100~107拷贝范围内， CT值(C代表cycle，T代表threshold；CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)与起始模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.991. 结论：所建立的基于SYBR Green I双链嵌合染料的大鼠I型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点，适用于进一步的各种组织的大量样本检测.

　　【关键词】 基因表达；聚合酶链反应；I型胶原；mRNA

　　0引言

　　近年来，肿瘤间质的来源及间质成分的变化［1］与肿瘤浸润转移的关系［2］逐渐受到人们的重视；骨、牙齿及皮肤等发育［3］的各个时期中各种主要组成成分的表达量的变化也成为发育和疾病监控在基础研究方面的趋势. 而这些领域的研究热点常集中在基质金属蛋白酶及其抑制剂的研究上，而对作为细胞外基质主要成分之一的I型胶原的表达变化却少有报道. 实时荧光PCR技术是目前最准确、重现性最好和国际公认的核酸分子定量定性检测标准方法, 被广泛用于转基因研究、基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域［4-7］. 已出现的荧光定量PCR方法有多种，其中应用前景最广的方法是SYBR Green I荧光染料法［8］ 和TaqMan探针法［9］. 本文基于SYBR Green I荧光染料利用实时荧光PCR技术就建立检测大鼠I型胶原表达水平的方法进行探讨.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　SD大鼠（6 wk）取自西京肝胆外科，体质量225 g. 总RNA提取、逆转录相关试剂使用invitrogen产品；pMD18T载体(TaKaRa公司)；PCR产物清洁试剂(Vitagene技术有限公司)；SYBR Green I荧光染料(罗氏公司)；DH5а感受态菌株(本所保存); 普通PCR仪(TECHNE)；实时荧光定量PCR仪DNA Engine OPTICONTM (MJ Research)；DU640核酸及蛋白分析仪(Beckman公司)；凝胶成像系统(Kodak公司).

　　1.2方法

　　1.2.1抽提总RNA正常大鼠处死，取80 mg肝脏组织，按Trizol操作说明书提取总RNA. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定所提RNA的完整性. 测定吸光度，确定RNA的含量和纯度.

　　1.2.2目的cDNA的PCR扩增按反转录试剂说明书进行cDNA的合成. 根据大鼠I型胶原mRNA序列［10］，运用DNASTAR软件设计一对特异性引物，分别为：5′CTCAGGGGCGAAGGCAACAGT3′和5′ATGGGCAGGCGGGAGGTCT3′. 扩增片段长度为125 bp. 反应参数为95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸20 s，共35个循环.

　　1.2.3参比模板质粒构建PCR扩增产物纯化后，克隆至pMD18T载体，由上海生物工程公司进行序列测定.

　　1.2.4实时荧光PCR反应系统敏感性测试及线性标准曲线绘制提取参比模板质粒，定量后分级10倍稀释至5×105/L，分别取每一数量级稀释液2 μL作为PCR模板，即每50 μL反应体系中含有模板拷贝数分别为100，101，102，103，104，105，106，107，108. 除反应体系中引入2×SYBR Green I荧光染料［11］及循环数改为50外，其他同上，同时设立以水和空载质粒为模板（即靶基因拷贝为0）的对照反应.

　　1.2.5实时荧光PCR反应系统特异性评定基于SYBR Green I荧光染料的实时PCR反应的特异性评定是通过分析PCR产物的熔链曲线来实现的，不同的PCR产物其熔链曲线也不同. 将实时定量RTPCR产物从50℃缓慢而均匀地升温至100℃，温度每升高0.2℃读一次荧光值，每两次读值间隔1 s，由实时荧光定量PCR仪自动绘制熔链曲线.

　　2结果

　　所提RNA吸光度A260 nm/A280 nm=1.8，浓度为0.69684 g/L. 20 g/L琼脂糖变性电泳见5 s，18 s，28 s三条清晰条带. PCR扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳可见大小约为125 bp(图1). 经在线序列相似性分析(Blastn)，所克隆序列同靶基因序列有100%的同源性.

　　在100至108 DNA拷贝/每反应范围内(图2)，Ct值和DNA拷贝数呈线性关系（y=-0.31x+12.52；r>0.990）. 所建立的实时荧光PCR反应系统的检测最低限度可达1拷贝/反应(图3). 除最高浓度参比品及对照品外(图4)，其他浓度参比品扩增产物的熔解曲线一致.
M：DL2000 marker；1：I型胶原cDNA.

　　3讨论

　　基于SYBR Green I荧光染料所建立的实时PCR法具有无毒、无放射性污染、操作简便、不需设计特异性荧光探针及其配套引物、敏感性高、反应条件优化和设计思路简单、成本较低等特点，只要反应条件合适即可实现任何目的基因的实时定量. 但由于SYBR Green I荧光染料为双链DNA特异性染色，它不仅和靶基因的扩增产物结合，也会同非特异性PCR产物结合，从而影响结果判断. 故引物设计及PCR条件优化显得尤为重要，要求务必确保PCR扩增产物的条带清晰且单一.

　　进行熔链反应时，随着温度逐渐升高双链解链，荧光信号随之下降. 当温度在Tm值左右时双链数量急剧减少，荧光量也急剧下降，由此可确定Tm值. 结果显示特异扩增产物熔解温度均一、峰的形状也比较锐利，空白对照熔解曲线同靶基因产物的明显不同. 实时PCR反应结束时应减去空白信号以去除二聚体等实物的影响，也可直接通过控制循环次数以使反应在出现明显的二聚体信号前结束. 在实验中也发现含有108拷贝参比模板的反应Tm值同其他梯度参比模板有偏差，可能主要是高拷贝数载体的双链DNA所引起的. 由于在定量分析时，每反应通常只需各取103，104，105和106个拷贝的模板为参比品，故此值并不影响今后的检测分析.

　　【】

　　［1］ Ivarsson M, McWhirter A, Borg TK, et al. Type I collagen synthesis in cultured human fibroblasts: Regulation by cell spreading,plateletderived growth factor and interactions with collagen fibers［J］. Matrix Biol, 1998,16(7):409-425.

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