中药补肾方剂对大鼠骨肉瘤细胞增殖及相关酶活性的影响

【关键词】  中药

　　Effect of Chinese medicine Bushen recipe on proliferation and protein kinase activity in rat osteoblastlike cells in vitro

　　【Abstract】 AIM: To study the effect of Chinese medicine Bushen recipe (BSR) on proliferation and protein kinase activity of cellular signaling transduction system in rat osteoblastlike cells (UMR106). METHODS:  UMR106 cells were cultured in MEM and divided into BSR groups (at different doses of Bushen recipe) and control group. The proliferation of UMR106 cells was measured by MTT assay. The protein kinase samples were prepared and the activity of tyrosine protein kinase (TPK) and protein kinase C (PKC) was indicated as mol of 32PATP incorporation. RESULTS:  By concentration of 1×10-1-1×10-5 g/L of Bushen recipe, the cell proliferation was promoted. By 1×10-4 g/L, the TPK and PKC activity increased by 44.8% and 95.1% respectively in UMR106 cells. CONCLUSION:  BSR dose could activate and improves cellular signaling transduction in UMR106 cells. The proliferation of the cells may be due to this process.

　　【Keywords】 bushen recipe; osteoblastlike cell; cell proliferation; protein kinase

　　【摘要】 目的：探讨中药补肾方剂对成骨样细胞UMR106增殖及相关蛋白激酶活性的影响. 方法：用不同剂量的中药补肾方剂与成骨样细胞UMR106共同培养，以MTT法检测细胞的增殖，用32PATP参入反应底物中的摩尔数表示蛋白激酶的活性. 结果：该中药补肾方剂在1×10-1～1×10-5 g/L浓度范围均能增加成骨样细胞增殖（P＜0.05或P＜0.01），1×10-4 g/L浓度处理细胞可使酪氨酸蛋白激酶（TPK）和蛋白激酶C（PKC）活性分别增高44.8%和95.1%. 结论：中药补肾方剂可活跃和增进细胞的信号传导，这可能是其促细胞增殖的一种机制.

　　【关键词】 补肾方剂；成骨样细胞；细胞增殖；蛋白激酶

　　0引言

　　中药补肾方剂依据祖国传统医学肾主骨理论进行配方，用于老年骨质疏松症，对成骨样细胞有影响［1］. 大鼠成骨肉瘤细胞UMR106具有稳定、均一、纯度高的特点［2］，故用此细胞株研究中药制剂对成骨样细胞增殖的影响.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　MEM培养基为Gibco产品，小牛血清购自天津生物制品公司；γ32PATP购自中科院上海原子能研究所；Poly Glu∶Tyr［4∶1］，Poly Arg∶Ser（3∶1），ATP，cAMP，DG，磷脂酰丝氨酸，苯甲基磺酰氟（PMSF），胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin），亮胰蛋白酶肽 （Leupeptin），3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四唑氢溴酸盐（MTT）均购自Sigma公司；其余试剂为国产分析纯产品. 中药补肾方剂由淫羊霍、杜仲、熟地黄、地骨皮、淮牛膝、山茱萸各10 g组成，经生药教研室鉴定. 用三蒸水浸泡、煎煮2次，再经750 mL/L乙醇沉淀，回收乙醇，制成相当于生药2 kg/L的药液，调pH至7.0，过滤除菌，分装，密封放置冰箱备用. 大鼠成骨肉瘤细胞株UMR106由北京医科大学生物化学与分子生物学系转赠，源于美国哈佛医学院麻省总内分泌研究室，细胞培养于含100 mL/L小牛血清的MEM培养液中.

　　1．2方法

　　1.2.1MTT法检测细胞增殖UMR106细胞于50 mL/L CO2，37℃恒温培养. 长满后用胰酶和EDTA消化，铺入96孔细胞培养板中（1×108/L），0.2 mL/孔，继续培养24 h，然后加入不同浓度的含药无血清MEM培养液(每个浓度4个复孔)，对照组只加培养液. 实验组按照不同加药浓度分为5组（表1）. 继续培养48 h，弃去含药细胞培养液，加入1 g/L的MTT溶液50 μL培养3 h后，吸去上清液，加入150 μL DMSO,待沉淀完全溶解后以595 nm为测定波长，655 nm为参比波长，测定吸光度值，按照x±2s作质量控制，凡是超出控制标准的均进行了复查. 以含有等体积的DMSO未加中药的细胞孔测得的吸光度值为空白对照.

　　1.2.2蛋白激酶活性测定细胞在含100 mL/L小牛血清的MEM培养液中培养. 长满后继续以无血清培养液继续培养48 h，然后换中药补肾方剂 (1×10-4 g/L)无血清ＭＥＭ培养液继续培养48 ｈ,每24 ｈ换液1次，对照组所用培养液不含补肾方剂. 待细胞用药物处理完毕后，用冷PBS洗细胞2次,迅速将细胞收集于15 mL离心管中，4℃, 3000 r/min离心5 min，弃去上清液，用Tris・HCl缓冲液25 mmol/L［pH 7.5］，蔗糖0.25 mol/L，EDTA和PMSF 1 mmol/L，MgCl2和KCl 5 mmol/L，Triton X100 5 mL/L，亮胰蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制剂少许悬浮细胞,液氮反复冻融3次,4℃,11 200 g/min离心10 min，取上清液,测定TPK和PKC活性. 酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase, TPK）反应体系的终浓度为：50 mmol/L Tris・HCl［pH 7.5］，50 μmol/L Na3VO4，7 g/L PNPP, 50 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L MnCl2, 8.5 g/L poly Glu∶Tyr［4∶1］. 蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）反应体系的终浓度为：20 mmol/L Tris・HCl［pH 7.5］，1 mmol/L CaCl2，1 μg DG，10 μg PS，1 g/L PolyArg∶Ser［3∶1］. 两体系分别加入5.55 kBq γ32PATP，并以蛋白含量，加入适量含酶细胞匀浆上清液，以启动反应，反应总体系50 μL，30℃准确保温，10 min后立即终止反应. 将反应液40 μL点至Whatman GF/C玻璃纤维滤膜,迅速置于冰冷0.61 mol/L TCA0.20 mol/L H2PO4中, 重复浸洗3次,再在室温条件下用0.30 mol/L TCA浸洗2次,每次30 min，最后用无水乙醇洗30 min，吹干后加闪烁液以Beckman液闪记录仪测cpm数. 结果以四重复x±s表示［5-6］.

　　统计学处理: 数据以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行Dunnett t检验.

　　2结果

　　2．1UMR106细胞增殖中药补肾方剂提取液对UMR106细胞增殖有促进作用，其中药物浓度在1×10-1和1×10-2 g/L时细胞增殖明显高于对照组（P<0.01，表1）.表1补肾方剂对成骨样细胞UMR106增殖的影响(略)

　　2．2UMR106细胞蛋白激酶活性经中药补肾方剂处理的ＵＭＲ106细胞各蛋白激酶活性均有不同程度的提高， PKC活性比对照组增高了95.1%（9726±1430 vs 4984±602，P<0.01），TPK活性比对照组增高了44.8%（5393±829 vs 3724±753， P<0.05）.

　　3讨论

　　《素问・六节脏象篇》中有“肾者……其充在骨”的说法. 我们应用成骨样细胞株UMR106，观察到中药补肾方剂能明显促进UMR106细胞的增殖，与中医传统理论相一致［3-4］. TPK与细胞生长关系密切，可以通过PLCγ磷酸化进一步激活PKC［5-6］. 用补肾中药作用于ＵＭＲ106细胞后两种与细胞增殖关系密切的蛋白激酶活性均有不同程度的提高，以PKC活性增幅更显著，表明本方剂促细胞增殖作用与细胞内信息传递系统有关.

　　【】

　　［1］ 高晓燕，孟燕彬，赵春颖． 补肾中药对成骨样细胞UMR106增殖的影响（Ⅱ）［J］.承德医学院学报，2002，19（1）：7-9.

　　［2］ 曲耀华，刘彬，张维娟，等. 甲状旁腺素促成骨样细胞增殖作用及其与钾离子通道的关系［J］.中医正骨，2002，14（6）：7-8.

　　［3］ 王长海，田立民，蒋永培，等. 中药骨松康老年性骨质疏松症的临床对照研究［J］.第四军医大学学报, 2003, 24(11)： 1029-1031.

　　［4］ 王四旺,郑本端,孙纪元，等. 安太胶囊治疗骨质疏松症168 例［J］.第四军医大学学报, 2003, 24(14)： 1324-1327.

　　［5］ Osada S, Saji S, Osada K. Critical role of extracellular signalregulated kinase phosphorylation on menadione (vitamin K3) induced growth inhibition［J］. Cancer， 2001； 91(6):1156-1165.

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