重组人TGF

【关键词】  重组

　　expression, purification and identification of recombinant human TGFβ1 fusion protein

　　【Abstract】 AIM: To clone, express and purify human transforming growth factor β1 (TGFβ1) in E.coli. METHODS:  A 336 bp of human rhTGFβ1 gene fragment was obtained by RTPCR and cloned into pGEX4T1 vector, a GST fusion expression vector. The plasmid was transformed into E.coli DH5α and induced to express fusion protein GST rhTGFβ1 with IPTG. The expression of rhTGFβ1 was detected by SDSPAGE and Western Blot. RESULTS:  A novel protein with expected molecular mass was expressed. The expressed product showed a good binding ability to antirhTGFβ1 monoclonal antibody. CONCLUSION:  Our successful cloning and expression of rhTGFβ1 gene and purification of rhTGFβ1 protein lay a basis for the production of rhTGFβ1 autovaccine.

　　【Keywords】 transforming growth factorβ1; recombinant fusion proteins / isolation & purification; pGEX4T1 vector

　　【摘要】 目的: 构建人转化生长因子β1（TGFβ1）基因的原核表达载体，表达并纯化GSThTGFβ1. 方法: 应用RTPCR获得人TGFβ1的基因片段，成功构建人TGFβ1原核表达载体,诱导表达人TGFβ1与GST的融合蛋白；应用亲和层析法纯化重组融合蛋白，对纯化产物进行SDSPAGE电泳分析和Western Blot检测分析. 结果: 成功构建了人TGFβ1重组融合表达质粒pGEX4T1TGFβ1, 表达的蛋白经SDSPAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGFβ1抗体特异性的结合能力. 结论: 成功构建了人TGFβ1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物，为下一步的人TGFβ1自体疫苗的研制奠定了基础.

　　【关键词】 转化生长因子β1；重组融合蛋白/分离与纯化；pGEX4T1载体

　　转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGFβ1）是一种免疫抑制因子，在多种肿瘤的发生、及转移中起重要作用，并几乎在所有内、外、中胚层源的实体瘤（包括肝癌细胞）及造血细胞来源的肿瘤中都有表达［1］. 其活性结构是由两个结构相同、Mr为12.5×103的亚单位借二硫键相连成同源二聚体的形式存在，其生物学活性的发挥由细胞膜上的特异性受体介导［2］. 研究［3］显示对于高表达TGFβ1的晚期肿瘤患者，肿瘤细胞通过自身的调节与适应基本上失去了对TGFβ1诱导的生长抑制效应. 肿瘤细胞高表达的TGFβ1主要是作用于免疫细胞和基质细胞，发挥有利于肿瘤生长和转移的作用. 体内阻断TGFβ1的生物活性能发挥明显的抗肿瘤作用. 我们利用基因重组的方法，构建TGFβ1的融合表达载体，为下一步的人TGFβ1自体疫苗的研制奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　E.coli DH5α及质粒pGEX4T1为本室保存;各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG) (TaKaRa公司)； 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）； 蛋白marker（Fermentas公司）；抗hTGFβ1 mAb（Invivogen公司）；羊抗小鼠二抗（华美生物工程有限公司）； 碱性磷酸酶显色试剂盒、反转录试剂盒（Promega公司）；Trizol 试剂盒（Gibco BRL公司）； 4℃高速离心机（Beckman公司）；蛋白质层析设备（Amersharm PharmaciaBiotech 公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1外周血单个核细胞的分离、培养［4］及总RNA的提取分离外周血单个核细胞按常规方法进行；细胞总mRNA的提取按Gibco BRL公司的Trizol试剂盒说明书进行,用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA 浓度和纯度. -70℃保存RNA备用.

　　1.2.2RTPCR及PCR扩增目标序列以人外周血单个核细胞总mRNA为模板，根据Genbank提供的hTGFβ1基因序列设计特异引物1和引物2进行RTPCR，按Promega产品说明书操作. 引物1：5′ GCGAATTCGCTCTGGACACCAACTATTGC 3′ (下划线部分为EcoRI酶切位点); 引物2：5′ GGTCGACTCAAGAGCACTTGCAGGAGCGCA 3′ (下划线部分为SalI酶切位点). 以所制备hTGFβ1 cDNA为模板，再进行PCR反应，扩增用于插入pGEX4T1表达载体的hTGFβ1 DNA片段. 反应条件为：94℃ 变性60 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s. 共进行30个循环.

　　1.2.3大肠杆菌表达载体的构建及诱导表达PCR反应完毕后，以15 g/L琼脂糖电泳鉴定PCR产物. 回收约350 bp的DNA片段，用EcoRI和SalI双酶切后插入表达质粒pGEX4T1相应酶切点中转化E.coli DH5α感受态菌株. 挑取重组菌落培养后提取质粒DNA，用EcoRI和SalI双酶切鉴定重组子. 后者再经DNA测序确定出序列正确的重组子，命名为pGEX4T1hTGFβ1. 重组质粒pGEX4T1hTGFβ1转化感受态DH5α，挑单克隆37℃培养过夜后，次日按1∶100转接于LB/Amp+培养基中，继续37℃摇动培养至对数生长中期，测A600 nm为0.4~0.6时，加IPTG使终浓度达0.5 mmol/L诱导表达4 h,收集菌体，行SDSPAGE.

　　1.2.4表达产物的纯化及Western Blot鉴定离心收集诱导表达细胞，将1 g菌（湿质量）用7 mL裂解缓冲液悬浮细胞后用超声波处理，4℃,12 000 g离心20 min去细胞碎片，弃上清，沉淀用含0.1 mL/L Triton X100和2 mol/L尿素的包涵体洗涤液洗2次，用8 mol/L尿素、50 mmol/L β巯基乙醇溶解，4℃,12 000 g离心20 min,上清透析在过柱缓冲液(PBS)中. 样品经GST亲合层析进行纯化. 对纯化后的蛋白取样，进行SDSPAGE. 将样品蛋白转移到硝酸纤维膜上，用抗hTGFβ1 mAb进行Western Blot鉴定.

　　2结果

　　2.1人TGFβ1基因的扩增、克隆及序列测定人TGFβ1的PCR产物经0.15 g/L AgaroseEB电泳检测，PCR产物中含约350 bp的特异性条带(图1),该片段大小与预测结果一致. 回收片段后插入到pGEX41融合表达载体中，酶切鉴定得到正确克隆(图2)，测序结果与［5］报道的人TGFβ1基因序列比对完全一致.

　　2.2人TGFβ1基因在大肠杆菌中的表达SDSPAGE电泳结果表明，含有pGEX4T1hTGFβ1的工程菌DH5α经0.5 mmol IPTG诱导后在Mr约为39×103处产生了一条新生GST融合蛋白，与预期结果相符合；而未诱导的则无相应蛋白条带出现（图3）.  裂菌后经SDSPAGE分析，目的蛋白以包涵体的形式存在，上清中无目的蛋白.

　　2.3融合蛋白的纯化及Western Blot鉴定目的蛋白经GST亲合层析纯化， SDSPAGE电泳分析结果见图4.  Western Blot结果显示目的蛋白与抗hTGFβ1 mAb有良好的结合反应（图5）.

　　3讨论

　　我们通过RTPCR的方法，从人外周血单核细胞中成功获取人成熟型TGFβ1的cDNA,构建了融合表达载体pGEX4T1hTGFβ1,并成功的在大肠杆菌中表达了融合蛋白GSThTGFβ1. 经Western Blot分析，重组的融合蛋白能够与小鼠抗人TGFβ1 mAb结合，说明融合蛋白具有TGFβ1的抗原性.

　TGFβ1是一种较强的免疫抑制因子，在肿瘤的负性免疫调节中起重要作用. 许多肿瘤如黑色素瘤、卵巢癌可通过产生释放该细胞因子而引起机体的免疫抑制. 体内阻断TGFβ1的生物活性能发挥明显的抗肿瘤作用. 目前，TGFβ1的抑制剂正处于研究阶段，例如反义核酸技术阻断TGFβ1合成，Tranilast阻断TGFβ1分泌［6］，抗TGFβ中和抗体［7-8］和天然抑制剂（Decorin）抑制TGFβ1与受体的结合及用抑制性Smad、缺失突变型的TGFβ受体(TβRIIDN)或可溶性的TβRIII/TβRII进行基因可以阻断TGF β1信号传导，以上都不同程度起到了抑制肿瘤生长与转移的作用. 但是由于技术或成本要求过高或者治疗上的高危险性，很难为广大肿瘤患者所接受. 近年来，自体分子疫苗在肿瘤治疗中取得了良好的效果，具有应用前景. 重组人TGFβ1原核表达载体的构建能够高效表达并纯化人TGFβ1融合蛋白，为下一步人TGFβ1自体疫苗的研制奠定了基础，对解除肿瘤患者的免疫抑制具有重要的意义.

　　【文献】

　　［1］ Mishra L, Derynck R,Mishra B. Transforming growth factor{beta} signaling in stem cells and cancer ［J］.Science,2005，310(5745):68-71.

　　［2］ Heldin CH, Miyazono K, ten Dijke P. TGFbeta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins［J］. Nature,1997， 390(6659): 465-471.

　　［3］ Derynck R， Akhurst RJ，Balmain A. TGFbeta signaling in tumor suppression and cancer progression［J］. Nature Genet，2001， 29(2): 117-129.

　　［4］ 苏海川，张惠中，范清宇，等.肿瘤坏死因子凋亡相关配体基因的克隆和表达［J］. 第四军医大学学报,2003，24(16):1482-1484.

　　［5］ Derynck R,Jarrett JA, Chen EY, et al. Human transforming growth factorbeta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed cells［J］. Nature, 1985，316(6030): 701-705.

　　［6］ Platten M,Wildbode C,Wick W,et al. N［3，4dimethoxycinnamoyl］anthranilic acid (tranilast) inhibit transforming growth factorbeta release and reduces migration and invasiveness of human malignant glioma cell［J］ . Int J Cancer， 2001，93(1):53-61.

　　［7］ WojtowictzPraga S,Verma UN,Wakefield L,et al.Modulation of B16 melanoma growth and metody and interleukin2［J］.J Immunother,1996，19(3):169-175.

　　［8］ Arteaga CL,Hurd SD,Winner AR,et al. Antitransforming growth factor (TGF)β antibodies inhibit breast cancer cell tumorigenicity and increase mouse spleen nature killer cell activity［J］.J Clin Invest,1993，92(6): 2569-2576.