姜黄素防治慢性心力衰竭大鼠左心室胶原网络重构的机制

                                                     作者：刘润侠,党慧敏,段中琪,狄灵,姚青海

【关键词】  姜黄素

　　Mechanism of curcumin in preventing left ventricular collagen network remodeling in rats with chronic heart failure

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of curcumin on the remodeling of the left ventricular collagen network in rats with chronic heart failure (CHF) and its mechanism. METHODS:  Pressure overloaded rat models were established by partial abdominal aorta ligation. The rats were divided into the shamoperated group, vehicle group, captopril group and curcumin group. Curcumin group was subdivided into the highdose, mediumdose and lowdose groups. After operation, we detected rat caudal arterial blood pressure weekly and observed cardiac hemodynamics at the 12th and 20th week. The content of cardiac muscle collagen and the expression of TNFα were detected. RESULTS:  At the end of the 12th week, the LVEDP, CVFV, CVFNV and TNFα in vehicle group were significantly increased compared with those in other groups（P<0.05）. Compared with that in vehicle group, the left ventricular function in curcumin group and captopril group were significantly ameliorated, as indicated by the decreased LVEDP, CVFV, CVFNV and TNFα (P<0.05), and the effect of highdose curcumin group was better (P<0.01). During different periods of CHF, there were significant differences in vehicle group, captopril group and curcumin groups (P<0.05). CONCLUSION:  It is the inhibitory effect of curcumin on TNFα and the oxidation that underlie the mechanism of curcumin in preventing collagen network remodeling and improving the cardiac function.

　　【Keywords】 curcumin; hemodynamics; collagen volume fraction; TNFα; collagen net remodeling

　　【摘要】 目的：研究姜黄素对慢性心力衰竭大鼠左心室胶原重构的影响及其作用机制. 方法：采用缩窄腹主动脉的方法，将大鼠随机分成假手术组、手术对照组、卡托普利组和姜黄素组，姜黄素组又分为高、中、低三个剂量组，术后每周测定鼠尾动脉血压，分别在术后12，20 wk观察心脏血流动力学变化,检测心肌胶原含量及心肌细胞TNFα的表达水平. 结果：12 wk末，手术对照组左心室舒张压(LVEDP)、胶原容积百分比（CVF）,肿瘤坏死因子（TNFα）的表达均明显强于其他各组，差别有统计学意义（P<0.05）；20 wk末，与手术对照组相比，姜黄素各剂量组和卡托普利组均能显著降低心衰大鼠的LVEDP，CVF，TNFα的表达(P<0.05)，姜黄素高剂量组作用更强(P<0.01). 不同时间段，手术对照组、卡托普利组和姜黄素各剂量组的前后差别均有统计学意义（P<0.05）. 结论：姜黄素通过对TNFα的抑制作用及抗氧化作用等多种机制抑制胶原重构，在一定程度上改善心功能，延缓了心力衰竭的进程.

　　【关键词】 姜黄素；血流动力学；胶原容积百分比；肿瘤坏死因子α；胶原网络重构

　　0引言

　　慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）形成和是一个涉及神经内分泌激活、心肌细胞能量代谢障碍等多因素的复杂过程，其核心内容在于心脏自身本质的变化-心室重构，而肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNFα）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）等在心室重构的过程中起关键性作用,可能与以上因素刺激胶原合成,导致心肌纤维化和细胞外基质重构有关［1-2］. 姜黄素（curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄 （curcumalonga）根茎中提取的一种酚类色素,其具有抗氧化、抗炎及抗纤维化等作用［3］，可有效抑制或减轻多种原因导致的肺、肝、肾纤维化进程［4-5］，目前尚少有关于其对CHF过程中心肌纤维化影响的报道. 我们观察姜黄素对于CHF模型大鼠心肌胶原网络重构的影响，初步探讨其作用机制，为开发抗左室重构的中药提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康Wistar大鼠120只，雌雄各半，体质量230～250 g，由西安大学医学院动物实验中心提供. 姜黄素（分子式C21H20O6,纯度95.68%，陕西赛德高科生物股份有限公司）；卡托普利片(中美上海施贵宝制药有限公司)；兔抗人、兔、鼠TNFα pAb（武汉Boster公司）；Ultra Sensitive TM SP免疫组化染色试剂盒及液体DAB酶底物显色试剂盒（福州迈新生物工程公司）. 鼠尾动脉血压仪（成都泰盟科技有限公司）BL420E生物机能实验系统；SJ42型四道生理记录仪（上海医用仪器厂）；Leica Q550CW图像分析系统.

　　1.2方法

　　1.2.1动物模型的制作按［6］,150 g/L戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉,钝性分离暴露腹主动脉. 用4号医用丝线将直径约0.9 mm的9号注射针头与腹主动脉一起平行结扎,抽出针头,形成腹主动脉狭窄(横截面减少40%～50%)，关腹. 术后,青霉素24万Ｕ/（kg・ｄ）,共3 d.

　　1.2.2动物分组及处理随机取20只大鼠为A组即假手术组,手术分离腹主动脉而不结扎. 手术24 h后,蒸馏水灌胃15 μL/kg,１次/ｄ,连续12 wk或20 wk. 将造模4 wk后的大鼠100只随机分为5组:①B组即手术对照组，20只，蒸馏水灌胃15 μL/kg；②C组即卡托普利组，20只,用蒸馏水溶解卡托普利50 mg/kg后灌胃; ③D，E，F组分别为姜黄素低、中、高剂量组，每组各20只，将姜黄素粉溶于70 mmol/L聚乙二醇的水溶液中（浓度为60 mmol/L），分别按200，100，50 mg/kg灌胃. 以上各组每日给药1次,连续12或20 wk.

　　1.2.3观察指标

　　1.2.3.1尾动脉血压的测定用大鼠尾动脉血压仪，每周测安静状态下大鼠尾动脉血压,记录收缩压.

　　1.2.3.2心脏血流动力学测定给药12或20 wk后,分别将10只大鼠麻醉后固定,分离右侧颈总动脉,由颈总动脉插管至左心室,连接桥式放大器经Powerlab4SP系统,记录左心室收缩压(LVSP),左心室舒张压(LVEDP),左心室最大收缩/舒张速率(±dp/dtmax).

　　1.2.3.3心肌胶原染色采用苦味酸品红VG染色，染色后的心肌细胞成黄色，胶原成红色. 用Leica Q550CW图像分析系统进行定量分析,胶原含量用容积百分比（CVF）表示，每张切片随机取6个不含小血管的视野，6个有小血管的视野，分别无小血管的容积百分比（CVFNV）和含小血管的容积百分比（CVFV）的均值.

　　1.2.3.4TNFα表达的SP免疫组化染色采用链霉素亲生物素蛋白过氧化酶复合技术进行TNFα免疫组化染色. 免疫组化染色步骤按SP试剂盒进行操作. 标本随机选取6个视野400倍光镜下进行观察. 应用Leica Q550CW彩色图像分析系统对TNFα的蛋白表达进行分析. 阳性反应为核（蓝染部分）周围及胞质呈棕褐色，用灰度值来表示表达强度.

　　统计学处理： 所有数据均采用x±s表示，各测量值间的比较用Oneway ANOVA方差分析，相关性检验用两变量的相关性分析方法，P<0.05为具有显著性差异.

　　2结果

　　2.1血压变化手术对照组大鼠随饲养时间延长而收缩压逐渐升高,4 wk后收缩压明显高于同期假手术组(图1). 连续给药20 wk,姜黄素组及卡托普利组大鼠血压明显低于手术对照组，但姜黄素组与卡托普利组间无显著差异（P>0.05）.

　　2.2血流动力学改变在12 wk后,大鼠形成明显的心力衰竭,表现为手术对照组大鼠LVEDP明显升高(P<0.05),±ｄｐ/ｄｔmax下降. 与手术对照组比较,姜黄素可明显改善心衰大鼠的心脏收缩功能,使心脏的收缩速率升高(+ｄｐ/ｄｔmax增加)(P<0.05), 但对心室的舒张功能无明显改善. 20 wk后,与假手术组比较,手术对照组大鼠LVSP，LVEDP分别增加60.6%和30.3%，+ｄｐ/ｄｔmax,-ｄｐ/ｄｔmax分别降低49.7%和35.3%,表明心衰模型大鼠左心泵血功能显著下降,收缩功能明显减弱,循环系统有明显充血现象. 与手术对照组比较,姜黄素高剂量组与卡托普利组能显著增加心衰大鼠的+ｄｐ/ｄｔmax,明显降低LVSP,LVEDP (P<0.05),似姜黄素高剂量组更强(P<0.05). 表明姜黄素组大鼠心脏的收缩及舒张功能均较手术对照组有不同程度改善(表1).表1不同时间大鼠血流动力学指标的改变（略）

　　2.3姜黄素对心室胶原容积百分比的影响手术对照组的胶原容积百分比在不同时间段均高于假手术组、姜黄素组和卡托普利组（P<0.05）； 20 wk时，手术对照组、姜黄素组和卡托普利组的CVFNV和CVFV明显高于12 wk（P<0.05）. 说明在心衰的不断过程中，心室的重塑在逐渐进展，姜黄素及卡托普利能不同程度的阻滞这种进程，姜黄素的作用强度与其剂量成正相关. 同时，实验数据还显示，CVFV高于CVFNV，说明血管周围的心肌纤维化程度强于非血管周围的心肌（P<0.05,表2）.表2不同时间各组大鼠胶原容积百分比及肿瘤坏死因子表达灰度值的变化(略)

　　2.4姜黄素对TNFα表达的影响TNFα表达的灰度值与实际的表达量成反比关系，即灰度值越高，TNFα表达的越弱，灰度值越低，TNFα表达的越强. 在不同时间段，手术对照组TNFα的表达均明显强于假手术组和姜黄素组，这种差别有显著性意义（P<0.05）；不同时间段，假手术组TNFα的表达前后差别无显著性意义（P>0.05），而手术对照组和姜黄素各组的表达前后差别均有显著性意义（P<0.05）. 提示在心力衰竭的进程中，TNFα的表达有一个时间过程，姜黄素能显著抑制其表达，且其作用呈剂量依赖性(表2).

　　3讨论

　　心脏胶原对于维持心脏的几何形态、保证心肌细胞的性排列及收缩、舒张的有效性起主要作用. 本实验结果显示在术后12和20 wk的不同时期，随着心衰的不断进展，左心室CVFNV、CVFV也相应逐渐增加，提示心肌纤维化呈进行性发展，从而导致左心室壁顺应性下降，削弱了心脏的舒张功能. 同时，发现术后12 wk胶原纤维的沉积以血管周围为主，术后20 wk除血管周围的沉积外,心肌细胞的组织间隙也出现广泛的胶原纤维并且部分胶原断裂，胶原网络破坏，说明在心衰的进程中，随着胶原网络重构的逐渐加重，左心室心肌内胶原先由血管周围向邻近间质短距离延伸,以后延伸距离逐渐加大,把心肌分割成条纹状,最后出现取代部分心肌组织的疤痕.

    TNFα是由激活的巨噬细胞分泌的一类具有多种生物学效应的细胞因子，现已证明其可由成熟的心肌细胞分泌产生并参与多种心脏疾病的病理生理过程. 它能抑制心肌收缩力、促使心肌细胞凋亡和诱导心室重塑. 我们的实验发现，在术后12 wk和20 wk TNFα表达逐渐增强的同时，心功能也逐渐恶化，说明TNFα对心肌有直接损害作用，能引起细胞外基质的异常，导致胶原网络的重塑.
药理研究表明，姜黄素具有良好的抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化和抗诱变致癌作用. 本研究发现，姜黄素可提高左心室的收缩性，使心脏的收缩速率升高, 不同程度的改善左心室的收缩及舒张功能. 相同时间段姜黄素各组以及卡托普利组的CVFV和CVFNV明显低于手术对照组，姜黄素高剂量组更低些，以上结果提示姜黄素可不同程度地改善压力超负荷大鼠左心室功能并抑制心脏胶原网络的重构，其作用与剂量呈正相关.

　　我们的实验结果还表明，姜黄素能够抑制CHF模型大鼠心力衰竭进程中TNFα的表达，从而在一定程度上抑制心室胶原网络的重构，其具体的作用机制还不是非常确切，但是一些相关研究已证实姜黄素在其他疾病中对TNFα的表达有影响［7-8］. 首先，与姜黄素对炎症因子的抑制作用有关. 最新研究表明：慢性心衰的形成和发展是一个持续的炎症过程，主要是多种炎性细胞因子-TNFα，IL1，MMPs等在诱导重构中发挥着关键性病理作用. 本实验研究结果显示，在不同时期，姜黄素各组的TNFα的表达均明显低于手术对照组，说明姜黄素能有效抑制TNFα的表达，进而改善了心室重构. 其次，与姜黄素的抗氧化作用有关. 姜黄素作为一种细胞抗氧化剂，对于心、脑等重要器官具有保护作用，其效果强于胡萝卜素和维生素E ［9］. 另外，姜黄素还能够直接抑制凋亡基因，不同程度地减轻凋亡［5］，进而改善胶原的重构. 姜黄素本身具有的抗炎、抗氧化作用亦能不同程度地减轻凋亡，本实验虽没有做心肌相关凋亡基因的检测，据理推测，姜黄素可能有抑制心肌凋亡基因的作用，进而改善胶原的重构.

　　综上所述，可以推断出姜黄素可能通过对炎症因子TNFα等的抑制作用及抗氧化、抗凋亡等多种机制抑制胶原的重构，一定程度改善了心功能,延缓了心力衰竭的进程,在防治心力衰竭胶原网络重构方面有良好的应用前景.

　　【】

　　［1］ Li YY, Feng YQ, Kadokami T, et al. Myocardial extracellular matrix remodeling in transgenic mice overexpressin tumor necrosis factorα can be modulated by antitumor necorsis factorα therapy［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000,97(23):12746-12751.

　　［2］ Peterson JT, Li H, Dillon L, et al. Evolution of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor expression during heart failure progression in the infarcted rat［J］. Cardiovasc Res, 2000,46(2):307-315.

　　［3］ 中华人民共和国药典委员会编. 中华人民共和国药典［M］. 一部. 北京:化学出版社，2000: 218-225.

　　［4］ Punithavathi D, Venkatesan N, Babu M, et al. Curcumin inhibition of bleomycininduced pulmonary fibrosis in rats［J］. Br J Pharmacol, 2000,131(2): 169-172.

　　［5］  Jones EA, Shahed A, Shoskes DA, et al. Modulation of apoptotic and inflammatory genes by bioflavonoidsand angiotensin II inhibition in ureteral obstruction［J］. Urology, 2000, 56(2): 346-351.

　　［6］ 陈方,方卫华,王鹏飞,等. 大鼠充血性心力衰竭时内皮素改变及心钠素的影响［J］. 心血管杂志, 1998,3(2):67-69.

　　［7］ Jang MK, Sohn DH, Ryu JH, et al. Curcuminoid and sesquiterpenes as inhibitor of monocyte TNFα release from curcuma zedoaria［J］. Planta Med, 2001,67(6):550-552.

　　［8］ Grandjean L, Aquerriere A, Gangloff SC, et al. Relative contribution of NFκB, AP1 in the modulation by curcumin and pyrrolidine dithiocarbamate of the UVBinduced cytokine expression by kerationcyte［J］. Cytokine, 2002,18(3):168-177.

　　［9］ 王琰，王慕邹. 姜黄属常用中药的研究进展［J］.中国药学杂志, 2001, 36（2）：80-82.