精氨酸加压素及其受体对大鼠心肌成纤维细胞iNOS

【关键词】  精氨

　　Influences of arginine vasopressin and its receptors on iNOSNO system activity in cardiac fibroblasts

　　【Abstract】 AIM: To explore the influences of arginine vasopressin (AVP) and its receptors on inducible nitric oxide synthasenitric oxide (iNOSNO) system activity in cardiac fibroblasts (CFs). METHODS:  After CFs were isolated and cultured, nitric acid reductase method, spectrophotometry and RTPCR were used to detect the changes of iNOSNO system activity induced by AVP and its receptors. RESULTS:  AVP significantly enhanced CFs iNOSNO system activity. V1 receptor antagonist inhibited iNOSNO system activity in a concentrationdependent manner and 1×10-7 mol/L V1 receptor antagonist decreased iNOSNO system activity to the control level. V1 receptor antagonist and V1+V2 receptor antagonist had the same effects on iNOSNO system activity. CONCLUSION:  V1 receptor antagonist mediated iNOSNO system activity increases in AVPinduced CFs. V1 receptor antagonist may be a new target in the prevention and reversion of cardiac remodeling.

　　【Keywords】 cardiac fibroblasts; arginine vasopressin; arginine vasopressin receptors; nitric oxide

　　【摘要】 目的：探讨精氨酸加压素(AVP)及其受体对大鼠心肌成纤维细胞(CFs)诱导型一氧化氮合酶一氧化氮(iNOSNO)系统活性的影响. 方法：分离培养SD仔鼠CFs，采用硝酸还原酶法、分光光度法和RTPCR观察AVP及其受体拮抗剂对CFs iNOSNO系统活性的影响. 结果: AVP显著提高CFs iNOSNO系统活性. V1受体拮抗剂呈剂量依赖性地抑制AVP的这一作用，其中1×10-7 mol/L V1受体拮抗剂可将AVP诱导下CFs的iNOSNO系统活性抑制到基础状态水平. V1+V2受体拮抗剂具有与V1受体拮抗剂相似的作用. 结论：AVP干预下CFs iNOSNO系统活性增强由V1受体介导，V1受体可望成为阻断或逆转心脏重构的新靶点.

　　【关键词】 心肌成纤维细胞；精氨酸加压素；精氨酸加压素受体；一氧化氮

　　0引言

　　心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)过度增殖和胶原合成分泌过多是心脏重构的重要病理基础，一氧化氮(NO)可通过抑制CFs过度增殖和胶原合成分泌过多抑制心脏重构［1-2］. 精氨酸加压素(arginine vasopressin, AVP)能够诱导CFs诱导型一氧化氮合酶一氧化氮(iNOSNO)系统活性增加［3］，NO合成增多. 但AVP如何将这种细胞外信息传递至细胞内，目前尚不清楚. 心肌组织有AVP受体表达，AVP受体分为V1和V2两种类型［4］. AVP干预下CFs iNOSNO系统活性增加由哪一种受体介导尚少见报道. 我们用AVP受体拮抗剂干预AVP诱导下的CFs，观察其对CFs iNOSNO系统活性的影响，以了解AVP诱导CFs iNOSNO系统活性增加的信息传递途径，为防治心脏重构提供新的思路.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　实验用SD仔鼠(出生1~3 d, 第四军医大学动物中心)；AVP(美国Peninsular Lab)；V1受体拮抗剂、V1+V2受体拮抗剂(Sigma公司)；NO含量和NOS活性测定试剂盒(南京建成生物技术研究所)；TRIZOL裂解液、Oligo (dT)，MMLV反转录酶(Promega公司)；TaqDNA聚合酶(宝生物公司)；PCR引物由上海生物工程公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1CFs的分离、培养和鉴定无菌条件下取SD仔鼠心室，盐水漂洗后剪至2~3 mm3小块. 1.25 g/L胰蛋白酶37℃消化20~40 min，收集细胞，筛网过滤，1000 r/min离心. 将所得细胞沉淀物悬浮于含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液中，吹打分散后置于37℃，50 mL/L CO2孵箱中贴壁60~90 min，差速贴壁法去除心肌细胞. 培养细胞长至近融合状态时传代. 实验用2~3代细胞. 对CFs进行SABC法免疫组织化学染色：纤维连接蛋白染色阳性，血管平滑肌肌动蛋白染色阴性，符合CFs染色特征.

　　1.2.2实验分组实验分为对照组、AVP组(1×10-7 mol/L)，AVP+V1受体拮抗剂组(1×10-9，1×10-8，1×10-7 mol/L)和AVP+ V1+V2受体拮抗剂组(1×10-7 mol/L). CFs培养至近融合状态时无血清培养液驯化24 h，继之分组培养24 h收集培养液测定NO含量和NOS活性，收集细胞测定iNOS mRNA表达量. 每组试验重复3次.

　　1.2.3NO含量测定利用硝酸还原酶将NO3-还原为NO2-，通过比色法测定NO2-浓度推算NO含量. 操作按试剂盒说明进行.

　　1.2.4NOS活性测定NO与亲核物质生成有色化合物，通过NOS催化产生的NO量推算NOS活力. 操作按试剂盒说明进行.

　　1.2.5iNOS mRNA表达量测定按TRIZOL试剂说明书提取CFs总RNA. 反转录合成cDNA第一链，反转录产物进行PCR扩增. 其中鼠iNOS上下游引物序列分别为tcgagccctggaagacccacatct和gttgttcttcttccaaggtgtttgccttat，PCR产物为276 bp. 鼠磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上下游引物序列分别为tattgggcgcctggtcacca和ccaccttcttgatgtcatca，PCR产物为746 bp. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行图像分析，以iNOS mRNA/GAPDH mRNA电泳带荧光强度比值作为iNOS mRNA表达量指标.

　　统计学处理： 数据以x±s表示，应用SPSS统计软件对资料进分析. 多组均数比较采用F检验，组间比较采用LSD法，P<0.05表示差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1AVP及其V1受体拮抗剂对CFs NOS活性和NO含量的影响对照组CFs具有NOS活性，能够合成NO. AVP干预下CFs NOS活性显著增强，NO含量显著增高(P<0.05). V1受体拮抗剂呈剂量依赖性地抑制CFs 的NOS活性和NO含量，其中1×10-7 mol/L V1受体拮抗剂可将AVP诱导下CFs的NOS活性和NO含量抑制到与对照组相近水平(P>0.05, 图1A,B).

　　2.2AVP及其V1受体拮抗剂对CFs iNOS mRNA表达的影响对照组CFs有iNOS mRNA表达(0.25±0.04). AVP干预下CFs iNOS mRNA表达显著增强(0.70±0.03, P<0.05). V1受体拮抗剂呈剂量依赖性地抑制CFs iNOS mRNA表达(1×10-9 mol/L：0.61±0.10; 1×10-8 mol/L：0.49±0.10; 1×10-7 mol/L：0.31±0.05). 其中1×10-7 mol/L V1受体拮抗剂可将AVP诱导下CFs的iNOS mRNA表达抑制到与对照组相近水平(P>0.05, 图2).

　　2.3V1受体拮抗剂与V1+V2受体拮抗剂对CFs iNOSNO系统活性影响的比较V1+V2受体拮抗剂与V1受体拮抗剂均可将AVP诱导下CFs iNOS mRNA表达(0.28±0.06和0.31±0.05)，NOS活性［(417±175和500±183) μkat/L］和NO含量［(34±14和36±12) μmol/L］抑制到与对照组［(0.25±0.04), (450±83) μkat/L和(29±5) μmol/L］相近水平，两者间差异无统计学意义.

　　3讨论

　　AVP是下丘脑分泌的九肽神经内分泌激素，机体许多组织细胞膜上都有AVP特异性受体存在. AVP通过与其特异性受体结合，激活不同的细胞内信号传递系统，发挥不同的生物效应. 根据AVP受体后信号传递的第二信使系统不同，将AVP受体分为V1(第二信使为蛋白激酶C)和V2(第二信使为蛋白激酶A)两种类型［5］，V1和V2受体都有自己特异性的受体拮抗剂.

　　AVP受体拮抗剂是研究AVP生理作用的有效药理工具，心肌组织中有V1，V2两种AVP受体表达［6］，AVP应该通过其受体作用改变CFs iNOSNO系统活性. 我们采用AVP受体拮抗剂干预AVP诱导下的CFs，结果发现：①基础状态下CFs有iNOS mRNA表达，具有NOS活性，能够合成一定量的NO. 1×10-7 mol/L AVP 显著提高CFs iNOS mRNA表达，增强NOS活性，增加NO合成；②V1受体拮抗剂呈剂量依赖性地抑制AVP对CFs iNOSNO系统活性的提高作用，其中1×10-7 mol/L V1受体拮抗剂可将AVP对CFs iNOSNO系统活性的提高作用抑制到与基础状态相近；③V1+V2受体拮抗剂和V1受体拮抗剂对CFs iNOSNO系统活性的抑制作用相似，说明AVP对CFs iNOSNO系统活性的提高作用主要由V1受体介导.

　　心脏重构导致心肌收缩力下降、舒张功能减退和心电紊乱，是心力衰竭、心律失常和心性猝死发生的重要环节［7］. AVP干预下CFs NO合成增加具有重要的病理生理意义. 近年研究发现心脏组织自身能够合成AVP［8］，在心肌梗死、高血压性心脏病、心力衰竭等临床病理情况下，心肌组织中AVP含量显著增高［9］，AVP含量增高能够诱导CFs NO合成增加，NO合成增加抑制了上述病理情况下CFs异常增殖和胶原合成分泌过多，从而抑制心脏重构. 因此，AVP干预下CFs NO合成增加是心脏组织自身对病理性损伤的一种自我保护机制. 我们的实验证实V1受体介导了AVP干预下CFs iNOSNO系统活性提高的调节，提示V1受体有可能成为今后阻断或逆转心肌纤维化的一个新的作用靶点.

　　【】

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