Paxillin在大鼠胰腺不同发育阶段的表达

                               作者：郭静，滕丽萍，刘莉洁，程梅，蔺扬波，德伟

【关键词】  桩蛋白；胰岛形成；逆转录聚合酶链反应；基因芯片

　　Expression of paxillin during rat pancreatic development

　　【Abstract】AIM:  To investigate the expression profile of genes related to islet formation and maturation during pancreas development. METHODS: The gene expression patterns in embryonic day 12.5(E12.5), E15.5, E18.5, newborn and adult pancreas were compared by using the GeneChip RAE 230A. The expressions of paxillin and actopaxin at different stages of rat pancreatic development were  detected by RTPCR. RESULTS: Genes related to cell migration and adhesion (77.8%) were  expressed at the highest level at E18.5, and the other ones (22.2%) peaked in newborn rats.  The expression level of adult pancreas specific genes began to increase from E18.5, while some transcriptional factors expression began to decrease from E18.5. Paxillin and actopaxin were  expressed at the highest level at E15.5. CONCLUSION: The later embryonic period may be important to pancreas development. Paxillin may play an important role in islet formation.

　　【Keywords】 paxillin; islet formation; reverse transcriptase polymerase chain reaction; genechip

　　【摘要】 目的： 探讨与胰岛形成和功能完善相关的基因在大鼠胰腺发育不同阶段的表达趋势. 方法： 采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5 d（E12.5），E15.5，E18.5， 新生和成年大鼠胰腺进行基因转录水平分析，并用RTPCR验证桩蛋白（pxn）和actopaxin在不同发育时期的表达情况.  结果： 与细胞迁移、聚集黏附相关的基因77.8%在胚胎18.5 d高表达，22.2%在新生期高表达；整合素和激酶（ILK）在胚胎18.5 d表达量最高，pxn和actopaxin在胚胎15.5 d表达量达到高峰；成熟胰腺特异性基因多从胚胎18.5 d开始出现明显高表达，调节胰腺细胞分化的相关转录因子表达量多从胚胎18.5 d开始下降. 结论： Pxn在胚胎发育中后期的高表达可能与胰岛形成及功能完善有关.
 
　　【关键词】 桩蛋白；胰岛形成；逆转录聚合酶链反应；基因芯片

　　0引言
　　
　　胰腺的发育由复杂的基因调控，2004年Gu等［1］以基因芯片技术建立了胰岛分化相关转录因子的表达调控网络，然而胚胎发育后期胰岛细胞迁移聚集形成胰岛的相关机制尚未阐明. 桩蛋白 (paxillin, pxn)是一种细胞骨架上的磷酸蛋白，Mr为68×103，构成胞外基质(extracellular matrix, ECM)与细胞骨架联系纽带，调节细胞移动和播散［2］. 目前pxn在胰腺发育中的表达及相关功能的研究少见报道. 本研究我们应用基因芯片技术建立大鼠胰腺不同发育时期的基因表达谱，明确其参与细胞黏附聚集和迁移相关基因的表达趋势，并应用RTPCR验证pxn和actopaxin的表达，为研究pxn在胰岛形成的作用提供线索.
 
　　1材料和方法

　　1.1 材料成年SD大鼠45只，雌30只，雄15只,平均体质量250 g，由南京医科大学实验动物中心提供. 于每日18:00，将雌雄以1∶2合笼，次日检测有阴栓者，定为受精0.5 d（embryonic day 0.5, E0.5），取E12.5,E15.5,E18.5胚胎大鼠胰腺以及新生（出生1 d）和成年大鼠胰腺. PCR仪（德国，Eppendorf）；XTLVI解剖镜（江西凤凰光学仪器有限公司）；RNA转录标记试剂盒，大鼠表达谱芯片RAE230A，芯片杂交炉， 扫描仪，数据采集软件和微阵列分析软件（美国，Affymetrix）；Tripure试剂(美国,Roche)；RNA纯化试剂盒（德国,Qiagen）；RNA PCR 试剂盒（日本，Takara）. 引物由北京赛百盛基因有限公司合成.

　　1.2方法
 
　　1．2．1胰腺组织分离将E12.5,E15.5,E18.5母鼠引颈处死,分离出胚胎,解剖镜下用显微镊子取出胰腺, 直接分离新生和成年大鼠胰腺, 迅速在液氮中冷冻.

　　1．2．2RNA提取每50~100 mg组织加1 mL RNA抽提剂，充分匀浆. 匀浆后室温放置 5 min ，加入氯仿200 μL，剧烈振荡 15 s，室温放置2~3 min，4 ℃ 12 000 g离心15 min. 将上清液转入新离心管中，加等量异丙醇沉淀RNA，室温放置10 min，4 ℃  12 000 g离心10 min. 弃上清，加1 mL 750 mL/L乙醇，振荡洗涤沉淀，4 ℃ 7500 g 离心5 min. 弃上清，晾干，将RNA溶于 30~50 μL 焦碳酸二乙酯水，测定其浓度，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，收集经凝胶成像系统观察到28 s rRNA与18 s rRNA比值接近2∶1的RNA，保存于-70℃冰箱. 利用RNA纯化试剂盒纯化总RNA.

　　1．2．3寡核苷酸芯片分析mRNA表达分别以15 μg  E12.5, E15.5, E18.5，新生和成年大鼠胰腺总RNA为模板合成双链cDNA，采用RNA转录标记试剂盒体外转录生成生物素标记的cRNA；再经纯化和片段化处理后，取30 μg cRNA与大鼠表达谱芯片RAE230A杂交；洗脱后，用链酶亲和素－藻红蛋白进行染色扫描检测信号；对获得的信号在微阵列分析软件上进行数据分析并对样品的表达结果采用线性度量的方法在样品间进行校准. E12.5及成年大鼠胰腺寡核苷酸芯片重复2次.
 
　　1．2．4RTPCR取1 μg E12.5,E15.5,E18.5，新生和成年大鼠5个时期胰腺组织总RNA进行反转录:30℃ 10 min, 42℃  20 min, 99℃ 5 min, 4℃  5 min, 合成cDNA. PCR扩增：pxn上游引物：5′GGAGCAGAACGACAAGCC3′,下游引物：5′GCACAGAGCCCAGGAGA3′,预计扩增产物256 bp. actopaxin上游引物：5′GGAGGAGAATGAGGTGCG3′,下游引物：5′GCCGAGGTTTAGGCTTTT3′,预计扩增产物812 bp. 18 s rRNA上游引物：5′ACGAACCAGAGCGAAAGC3′，下游引物：5′GGA CATCTAAGGGCATCACAG3′,预计扩增产物514 bp. actopaxin和18 s rRNA的PCR条件: 94℃ 2 min；94℃ 30 s, 52.2℃ 1 min, 72℃ 2 min, 35个循环. pxn的PCR条件: 94℃ 2 min；94℃ 30 s,53.4℃ 30 s,72℃ 45 s,32个循环. RTPCR均重复3次.
 
　　2结果

　　2.1与细胞迁移、聚集黏附相关的基因表达基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，组织金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)，间皮素（mesothelin），钙黏素（Cadherins）等基因在大鼠胰腺发育不同阶段的表达趋势见表1，其中77.8%于胚胎18.5 d高表达，22.2%于新生期高表达（结果未完全显示）.

　　表1与细胞迁移、聚集黏附相关的基因表达谱　略

　　2.2整合素信号通路相关基因的表达整合素家族（integrin）相关基因在大鼠胰腺发育不同阶段的表达趋势(表2).  整合素和激酶（integrin linked kinase, ILK）在胚胎18.5 d表达量最高，而pxn和actopaxin在胚胎15.5 d表达量达到高峰，成年期表达量最低.

 
　　表2整合素信号通路相关基因表达谱　略

　　2.3成熟大鼠胰腺特异性基因及相关转录因子的表达胰岛素，胰多肽和淀粉酶等基因多从胚胎18.5 d开始出现明显高表达. 调节胰腺细胞分化的相关转录因子Pdx1，Nkx6.1和Pax4表达量从胚胎18.5 d开始下降（结果未显示）.
 
　　2.4pxn和actopaxin的RTPCRRTPCR结果显示，pxn和actopaxin在大鼠胰腺不同发育时期的差异表达：pxn在胚胎15.5 d表达量最高，随着胰腺发育表达量呈下降趋势；而actopaxin在胚胎18.5 d表达量最高，成年期表达量最低（图1）.

　　图1不同时期大鼠胰腺扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果　略
        
　　3讨论

　　以往对胰腺发育的研究多围绕调节细胞分化的相关因子，对于胚胎发育中后期生物学功能完善的具体机制研究较少.  我们应用芯片技术确立E12.5，E15.5，E18.5，新生和成年大鼠胰腺基因表达谱，以成年胰腺作为对照，全景式地展现在胰腺发育不同阶段基因的表达情况，为确保胰腺取材的准确可靠，应用RTPCR检测各时期样本胰岛素和胰高血糖素mRNA的表达［3-4］. 基因芯片结果提示在胚胎18.5 d之前以细胞分化为主，在胚胎18.5 d之后以典型结构形成和功能完善为主，这与胰腺在发育过程中的形态学改变及功能完善一致［5］.
 
　　pxn及其结合蛋白actopaxin［6］是整合素信号通路中的重要成员, 整合素信号通路在胚胎胰腺发育中调节胰岛细胞的黏附和迁移［7］. 到目前为止，围绕pxn和actopaxin的研究主要集中在肿瘤转移和损伤修复，胚胎发育也有涉及［8-9］，但多在胚胎整体发育中展开，没有具体到特定器官. 本研究首次在大鼠胰腺不同发育阶段检测pxn和actopaxin的表达，为研究pxn在胰腺发育中的作用提供线索.
　　
　　本研究我们应用基因芯片技术检测到在大鼠胰腺发育过程中，pxn表达高峰出现在胰岛形成的关键阶段，即胚胎15.5 d至胚胎18.5 d［5］，RTPCR的结果验证了pxn的表达. 这一现象提示具有调节细胞迁移黏附功能的pxn可能与胰岛形成有关. 从胚胎15.5 d到新生，胰腺完成胰岛结构形成、功能逐步完善以及出生后胰岛重塑［5］，actopaxin从胚胎15.5 d到新生的相对高表达提示其与胚胎发育后期胰岛形成和出生后的胰岛重塑相关. 基于pxn和actopaxin在细胞黏附与迁移中的重要作用，而典型胰岛结构形成与细胞黏附、聚集密切相关，pxn和actopaxin在胚胎胰腺发育中后期特异性高表达对胰岛形成的意义将是本课题组下一步研究的方向.
 
　　【】

　　［1］ Gu G, Wells JM, Dombkowski D, et al. Global expression analysis of gene regulatory pathways during endocrine pancreatic development［J］ .Development,2004,131（1）:165-179.

　　［2］ 刘长锁, 陈乃宏. 桩蛋白的结构与功能［J］. 生命的化学，2005，25（3）：208-211.

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　　［6］ Turner CE. Paxillin interactions［J］. J Cell Sci, 2000,113:4139-4140.

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