外源核苷酸对受损小鼠胸腺细胞DNA修复的影响

【关键词】  核苷酸；DNA损伤;,DNA修复；,彗星试验

　　Effect of exogenous nucleotides on repair of damaged DNA in mouse thymocytes

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of exogenous nucleotides on the repair of damaged DNA  in mouse thymocytes in vitro. METHODS: Thymocytes from Kunming male mice were treated with NmethylN′nitroNnitrosoguanidine (MNNG, 10 μmol/L) to induce DNA damage. DNAdamaged cells were cultured in basic or complete RPMI 1640 medium supplemented with different levels of nucleotides (0, 0.1, 1, 10 mmol/L). DNA damage and repair were analyzed at 2, 5 h with singlecell gel electrophoresis. RESULTS: Nucleotides had no significant effect on the percentage of comet cells at 2 h in basic medium (P>0.05), but the percentage of comet cells decreased significantly in complete medium with nucleotides supplementation (P<0.01). The nucleotides supplementation significantly decreased the percentage of comet cells at 5 h (P<0.01). Comet tail length had no significant difference among groups at 2 h in basic or complete medium (P>0.05). Nucleotides of 1, 10 mmol/L decreased comet tail length at 5 h in basic medium  (P<0.01) . The supplementation of 1, 10 mmol/L nucleotides decreased comet tail length at 5 h in complete medium (P<0.01). The percentage of DNArepaired cells was increased significantly with nucleotides supplementation between 2 and 5 h in basic (P<0.05) or complete medium (P<0.01). CONCLUSION: The supplementation of nucleotides can accelerate the repair of damaged DNA in mouse thymocytes in vitro. The effect of nucleotides is related with the supplemental levels of nucleotides.

　　【Keywords】 nucleotides; DNA damage; DNA repair; comet assay

　　【摘要】 目的： 探讨外源核苷酸对受损小鼠胸腺细胞DNA修复的影响. 方法：  采用10 μmol/L的N甲基N硝基N亚硝基胍（MNNG）诱导小鼠胸腺细胞DNA损伤后，在终浓度分别为0，0.1，1和10 mmol/L核苷酸的RPMI1640基础培养基或完全培养基中培养，在培养的第2，5 h采用单细胞凝胶电泳技术分析细胞DNA损伤和修复情况. 结果：  培养2 h时，基础培养基中各组间的拖尾细胞百分率差异无统计学意义（P>0.05）；完全培养基中核苷酸能降低拖尾率（P<0.01）. 5 h时，随着核苷酸添加浓度的升高，拖尾率均降低（P<0.01）. 在相同的培养基中，各组的彗星尾长在2 h差异无统计学意义（P＞0.05），5 h后，在基础培养基中添加1，10 mmol/L的核苷酸使得彗星尾长降低（P<0.05）；在完全培养基中添加1， 10 mmol/L的核苷酸也使得彗星尾长降低（P<0.01）. 在培养的2～5 h内，补充核苷酸均能提高基础培养基（P<0.05）和完全培养基（P<0.01）中DNA修复细胞的百分率. 结论：  外源核苷酸能明显促进受损小鼠胸腺细胞DNA的修复，且核苷酸的作用与其添加水平有关.

　　【关键词】 核苷酸；DNA损伤;DNA修复；彗星试验

　　0　引言

　　核苷酸作为条件必需营养素，在维持和提高机体免疫功能方面发挥重要作用［1］. 有研究表明核苷酸（nucleotides, NTS）对免疫细胞DNA具有保护作用，能够减轻毒物、高脂等引起的细胞DNA损伤［2-3］. 我们在先前的实验中也观察到核苷酸能够减轻烷化剂对小鼠胸腺细胞DNA的损伤程度［4］，但有关核苷酸对DNA损伤后的修复有无作用的研究报道较少. 本试验拟在体外采用烷化剂N甲基N硝基N亚硝基胍（NmethylN′nitroNnitrosoguanidine, MNNG）诱导小鼠胸腺细胞DNA损伤，旨在进一步探讨不同浓度的NTS对损伤后细胞DNA修复的影响.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　健康清洁级昆明种雄性小鼠6只，5周龄，体质量20 g（第二军医大学实验动物中心）； MNNG（瑞士Fluka公司）；RPMI1640培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（中科院上海生化所）；HEPES，谷氨酰胺（美国Amersco公司）；淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）；台盼蓝，5′AMP,5′CMP,5′GMP,5′UMP，5′TMP（美国Sigma公司），其他试剂均为国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞分离与处理

　　无菌条件下分离胸腺细胞，调节细胞悬液浓度为2×106个/mL. 将细胞分成2份，分别加入终浓度为0，10 μmol/L的MNNG，在37℃ CO2培养箱中作用0.5 h诱导细胞DNA损伤；离心去上清，用无菌PBS洗涤2次.

　　将不同浓度MNNG处理过的细胞再各分成2个处理组，其中A处理组加入RPMI1640基础培养基; B处理组加入完全培养基（基础培养基 + 10 g/L谷氨酰胺 + 100 mL/L 胎牛血清）培养. 每个处理组又均分成5组，分别加入终浓度为0，0.1，1，10 mmol/L的NTS. NTS组成：5′AMP∶5′CMP∶5′GMP∶5′TMP∶5′UMP = 3∶2∶2∶1.5∶1.5，采用RPMI1640基础培养基配制，调pH=7.2，-20℃保存. 于37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养,每个样品做5个重复. 在培养的第2，5 h选取细胞，按［5］的彗星电泳技术方法并稍作改动，分析细胞DNA损伤修复情况.

　　1.2.2彗星电泳

　　取100 μL 7 g/L正常熔点的琼脂糖凝胶铺在磨砂的载玻片上，作为低层胶；取10 μL细胞悬液与70 μL 7 g/L低熔点琼脂糖凝胶在37℃下混匀后铺在低层胶上，4℃凝固10 min；取85 μL 7 g/L低熔点琼脂糖凝胶铺第三层胶，4℃凝固10 min. 载玻片在4℃新鲜制备的细胞裂解液（2.5 mol/L NaCl, 100 mmol/L Na2EDTA, 10 mmol/L TrisHCl pH=10, 10 g/L肌氨酸钠）用前加入10 mL/L TritonX，100 mL/L DMSO中裂解1 h，然后在4℃电泳液中（1 mmol/L Na2EDTA, 300 mmol/L NaOH）解旋20 min，最后在25 V，300 mA条件下电泳30 min.

　　电泳结束后，用蒸馏水冲洗载玻片，25 μL 2 μg/mL的EB水溶液染色，在Olympus落射式荧光显微镜下观察载玻片. 每张片子观察100个细胞，拖尾细胞的百分率；用镜中标尺直接测量30个拖尾细胞的彗星总长和彗星头部直径,二者差值即为彗星尾长，取平均值作为该样品细胞DNA尾长. 按下列公式计算2～5 h 内DNA修复细胞百分率.
DNA修复细胞百分率(%)=(2 h拖尾细胞-5 h拖尾细胞)/2 h拖尾细胞×100%.

　　统计学处理： 实验结果采用SAS 8.2 统计软件进行方差分析和多重比较， P<0.05为差异有统计学意义.

　　2　结果

　　2.1NTS对拖尾细胞百分率的影响DNA损伤后的细胞在基础培养基中培养2 h时，不同浓度的NTS对拖尾细胞百分率无影响（P>0.05）. 培养5 h后拖尾细胞百分率低于2 h（P<0.01），且随着NTS添加量的增加，拖尾细胞数量减少. 在完全培养基中，拖尾细胞百分率的变化情况基本与基础培养基相同. 但2 h和5 h的拖尾细胞百分率都明显低于基础培养基中的细胞(表1).表1NTS对DNA受损小鼠胸腺细胞拖尾百分率的影响(略)

　　未经MNNG处理的细胞无论在基础培养基还是完全培养基中培养，添加NTS后各组细胞拖尾率在2 h和5 h差异均无统计学意义（P>0.05），但核苷酸有降低拖尾率的趋势.

　　2.2NTS对DNA修复

　　细胞百分率的影响10 μmol/L MNNG处理过的细胞在基础培养中培养的2～5 h内，补充1 mmol/L，10 mmol/L的NTS能提高DNA修复细胞百分率，与补充0 mmol/L和0.1 mmol/L NTS组比较差异有统计学意义（P<0.05）. 在完全培养基中，受损细胞DNA的修复速度较快，10 μmol/L MNNG处理后添加10 mmol/L NTS能提高DNA修复细胞百分率（P<0.05），但0，0.1和1 mmol/L NTS组组间差异无统计学意义（P>0.05）.

　　2.3NTS对彗星尾长的影响

　　2.3.1基础培养

　　基中NTS对彗星尾长的影响细胞DNA受损后，DNA断裂成小片断，电泳时DNA片断向阳极移动，形成彗星状. DNA损伤越严重，形成的片段越小，彗星尾长也就越大. 10 μmol/L MNNG处理后的细胞在补充不同浓度的NTS培养2 h后，各组间彗星尾长差异无统计学意义（P>0.05）；5 h后，补充1，10 mmol/L NTS使彗星尾长低于0 mmol/L NTS组（P<0.05，图1），但3个NTS补充剂量间差异无统计学意义（P>0.05）.
图1基础培养基中5 h NTS对彗星尾长的影响

　　2.3.2完全培养

　　基中NTS对彗星尾长的影响10 μmol/L MNNG处理后的细胞在加入NTS 2 h后，各个NTS浓度组间彗星尾长无明显变化（P>0.05）；5 h后随着NTS添加水平的升高，彗星尾长下降（P<0.01，图2）. 其中添加1 mmol/L和10 mmol/L NTS组的细胞DNA尾长低于同一处理中的0 mmol/L NTS组（P<0.01），与0 μmol/L MNNG处理中的0 mmol/L NTS组差异无统计学意义（P>0.05）. 3个NTS添加组间的彗星尾长差异也无统计学意义（P>0.05）.

　　3　讨论

　　马爱国等［6］认为补充脱氧核苷对氧化损伤的人外周血淋巴细胞DNA的修复没有影响. 而本研究结果表明，添加NTS混合物能促进烷化受损细胞DNA的修复，且NTS的作用与其添加水平有关. 两个实验结果的差异可能与添加物质的种类、水平以及DNA损伤机制等的不同有关. 在本实验中补充0.1 mmol/L的NTS对DNA损伤修复无影响，但补充1 mmol/L或10 mmol/L NTS能明显促进DNA的修复.

　　烷化损伤后DNA的修复方式主要是直接碱基修复和碱基切除修复，或者是核苷酸切除修复［7］. 外源核苷酸促进受损细胞DNA修复的机制可能有两种，一是淋巴细胞合成核苷酸的能力有限，外源核苷酸或核苷可被整合到细胞核苷酸池中，作为底物直接参与碱基或核苷酸的切除修复［2］；二是核苷酸可能通过调节损伤修复相关基因的表达来影响DNA的修复，因为研究发现小鼠辐射后给与外源RNA 6 h后即可引起组织损伤修复相关基因的高表达［8］. 在体内RNA被消化酶所分解，最终以核苷酸、核苷或碱基的形式被吸收进入组织细胞中，并发挥作用，据此我们推测核苷酸促进受损DNA修复的作用可能与某些基因的表达有关.
　　
　　实验采用的RPMI1640基础培养基属于合成培养基，而完全培养基是在基础培养基的基础上添加了胎牛血清和谷氨酰胺. 本实验在DNA损伤程度相同的情况下，完全培养基中的细胞DNA修复速度比基础培养基中的细胞快，这表明完全培养基中的谷氨酰胺和（或）血清中的某些物质也参与了DNA的修复. 这些物质与核苷酸在促进细胞DNA修复过程中的关系如何，还需要作进一步的探讨.

　　【】

　　［1］Gi l A. Modulation of the immune response mediated by dietary nucleotides ［J］. Eur J Clin Nutr, 2002, 56(3): 1-4.

　　［2］Salobir J, Rezar V, Pajk T, et al. Effect of nucleotide supplementation on lymphocyte DNA damage induced by dietary oxidative stress in pigs ［J］. Anim Sci, 2005, 81: 135-140.

　　［3］FrankiT, Pajk T, Rezar V, et al. The role of dietary nucleotides in reduction of DNA damage induced by T2 toxin and deoxynivalenol in chicken leukocytes ［J］. Food Chem Toxicol, 2006, 44: 1838-1844.

　　［4］王兰芳，乐国伟，施用晖，等. 外源核苷酸对免疫抑制小鼠胸腺细胞DNA损伤的影响［J］.营养学报，2004, 26（4）：257-261.

　　［5］Czechowska A, Poplawski T, Drzewoski J, et al. Imatinib (STI571) induces DNA damage in BCR/ABLexpressing leukemic cells but not in normal lymphocytes ［J］. ChemicoBiological Interactions, 2005, 152: 139-150.

　　［6］马爱国, 刘四朝, 杜卫, 等. 脱氧核苷对淋巴细胞DNA损伤修复的影响［J］. 营养学报, 2000, 22(1): 40-42.

　　［7］Drablos F, Feyzi E, Aas PA, et al. Alkylation damage in DNA and RNArepair mechanisms and medical significance ［J］. DNA Repair, 2004, 3: 1389-1407.

　　［8］崔大祥, 曾桂英, 王枫, 等. 外源RNA对辐射受损肠腺损伤修复基因表达的影响［J］. 生物化学与生物物理进展, 2001,  28(3): 353-357.