非小细胞肺癌组织FHIT和突变型P53表达的关联性及相互作用
作者：庄鹏晖，梁景仁，潘承恩，付军科，尚东
【摘要】 目的: 探讨FHIT和突变型P53在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达的相关性以及两者潜在的相互作用. 方法: 采用免疫组化PicTureTM通用型二步法，检测FHIT和突变型P53蛋白在63例NSCLC和12例肺良性病变组织中的表达. 结果: NSCLC组织FHIT阳性率(42.9%)低于肺良性病变组织(75.0%)；FHIT表达与病理分级(r=0.358, P<0.05), TNM分期(r=0.314, P<0.05)及淋巴结转移(r=0.380, P<0.05)相关. 突变型P53在NSCLC组织中阳性率(52.4%)高于正常肺组织(8.3%)；突变型P53表达与TNM分期(r=0.391, P<0.05)及淋巴结转移(r=0.250, P<0.05)相关，与病理分级无关联性. FHIT与突变型P53蛋白在63例NSCLC中表达相关(r=0.258, P<0.05). 结论: P53突变和FHIT表达下调对NSCLC发生、 均可能起重要作用， 在其病变过程中可能同时存在两条途径， 并可能相互交叉.
【关键词】 非小细胞肺癌
0引言
FHIT (fragile histidine triad)基因结构不稳定，肺癌及癌前病变组织中均有FHIT的缺失和转录异常，提示FHIT基因异常可能是肺癌发生的早期分子事件. 目前研究认为，FHIT和经典抑癌基因P53在肺癌发病机制中可能存在一定的联系［1］. 我们采用免疫组化PicTureTM通用型二步法，检测63例非小细胞肺癌(NSCLC)和12例肺良性病变组织FHIT和P53的表达，探讨两者的关联性及潜在的相互作用.
1材料和方法
1.1材料1994/2001年根治性切除NSCLC（病理证实）63(男35，女28)例，年龄35～79(平均58.2)岁. 鳞癌27例，腺癌36例；分化Ⅰ,Ⅱ级38例，Ⅲ级25例. 临床（pTNM）分期Ⅰ,Ⅱ期43例，Ⅲ期20例. 有淋巴结转移41例，无淋巴结转移22例. 石蜡组织标本制成4 μm厚的连续切片3张，2张进行免疫组化染色，1张进行HE染色复核诊断. 肺良性病变组织12(男11，女1)例，均来源于自发性气胸患者手术切除标本, 年龄19～27(平均23.9)岁. PV－6000通用型二步法免疫组化检测试剂盒, P53小鼠抗人mAb（浓缩液）（sc?8393）,FHIT兔抗人mAb（浓缩液）（ZA?0410）均购于北京中杉金桥生物技术有限公司.
1.2方法采用PicTureTM通用型二步法. 石蜡切片脱蜡，置于甲醇双氧水中，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤；置于微波炉内加热修复抗原，PBS缓冲液洗涤；滴加FHIT兔抗人mAb, P53小鼠抗人mAb，浓度分别均为1∶80，置湿盒内室温下孵育120 min，PBS缓冲液洗涤；滴加通用型PV?6000 PicTureTM通用型试剂80 μL，室温下孵育30 min，PBS缓冲液洗涤；DAB液中显色，显微镜下控制染色时间5 min. 自来水冲洗，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 每次染色均设对照作为染色质量控制标准. 阳性对照采用已知的表达FHIT和突变型P53的乳腺组织，空白对照采用PBS液代替第一抗原. 所有对照均与实验标本在相同条件下严格按照试剂盒推荐方法进行. 另取一组切片供HE染色复核诊断. 标准免疫组化阳性反应为棕黄色或黄色颗粒状着色，FHIT以细胞质中有棕黄色或黄色颗粒为阳性细胞，突变型P53以细胞核有棕黄色或黄色颗粒为阳性细胞. 阳性细胞数量记分0～4分（在400倍镜下选定10个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计1000个细胞，阳性细胞所占百分比. 计算公式：阳性细胞百分比＝阳性细胞数／所记数细胞总数×100%）. 0为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分. 染色强度记分0~3分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色. 两项乘积即为该免疫组化得分，乘积>3分者定为阳性.
统计学处理: 应用SPSS 11.5 for windows统计软件进行分析. FHIT和P53蛋白表达的统计学处理采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1FHIT和突变型P53蛋白的表达FHIT和突变型P53蛋白阳性着色分别在细胞质和细胞核（图1A，B）. 在肺良性疾病组织中FHIT阳性表达9例，阳性率为75.0%，P53阳性表达1例，阳性率为8.3%，在NSCLC中两者阳性表达分别为27和33例，阳性率分别为42.9%和52.4%. FHIT和突变型P53在肺良性疾病和NSCLC组织中表达水平有统计学差异(P<0.05).
2.2FHIT和突变型P53蛋白表达与NSCLC临床病理参数的关系FHIT蛋白表达水平与病理分级(r=0.358, P<0.05)，TNM分期(r=0.314, P<0.05)，淋巴结转移(r=0.380, P<0.05)相关，但与年龄、性别、组织学类型均无关. 突变型P53蛋白表达水平与TNM分期(r=0.391, P<0.05)和淋巴结转移(r=0.250, P<0.05)相关,但与年龄、性别、组织学类型、病理分级均无关（表1）.
2.3FHIT和突变型P53蛋白表达的相关性在63例NSCLC组织中, FHIT和突变型P53表达均呈阳性者12例, 突变型P53阳性FHIT阴性22例，突变型P53阴性FHIT阳性者18例, FHIT和突变型P53表达均呈阴性者11例. FHIT和突变型P53蛋白在NSCLC组织中的表达相关(r=0.258, P<0.05).
图1非小细胞肺癌FHIT 和P53蛋白阳性表达×400 略
表1FHIT和突变型P53阳性表达与非小细胞肺癌临床病理参数之间的关系［略］
3讨论
多种肿瘤抑癌基因的缺失被认为在肿瘤的生长中具有协调作用. FHIT表达缺失和P53突变是肺癌发生早期的重要分子事件，NSCLC中这种改变高度频发，FHIT约50%～75%，P53＞50%［2］，使得目前研究的焦点集中在FHIT和P53在肺癌发病机制中可能存在有联系. 然而阐明FHIT生物学作用以及它与P53潜在相互作用的研究却只得出体外实验的结果. Galmarini等［3］发现人类乳腺癌细胞株中突变型P53表达上调与FHIT表达下调相联系；Nishizaki等发现［4］FHIT可下调MDM2蛋白，从而使野生型P53蛋白稳定和积聚；Cavazzoni等［1］发现FHIT/P53联合表达的细胞株通过P21waf1途径协同抑制肿瘤细胞生长. 因此更进一步研究两者潜在的关联，明确两者的关系显得尤为重要. 我们应用免疫组化方法检测两者在NSCLC中的表达，探讨两者的关联性及潜在相互作用，也发现了FHIT和P53相关的现象. 我们的结果表明，NSCLC中FHIT蛋白表达阳性率为42.9%，并与病理分级，TNM分期，淋巴结转移相关；突变型P53蛋白表达阳性率为52.4%，与TNM分期和淋巴结转移相关，但与病理分级无关. 值得注意的是63例NSCLC组织中两者表达相关（P=0.034），当FHIT阳性表达时，突变型P53阳性率下降，反之FHIT阴性表达时，突变的无功能的P53阳性率上升(r=0.258, P<0.05). 由此我们认为，P53突变和FHIT表达下调对肺癌发生、可能起重要作用, 两者在NSCLC中的表达呈负相关. 因此，在NSCLC病变过程中两条途径可能同时存在，并可能相互交叉. 通过明确两种抑癌基因的相互关系，将为今后进一步寻找两者协调作用的关键位点指明方向，为阐明抑癌基因发挥作用的途径，以及最终攻克肺癌奠定基础.
【】
［1］ Cavazzoni A, Galetti M, Fumarola C, et al. Effect of inducible FHIT and p53expression in the Calu-1 lung cancer cell line［J］. Cancer Lett, 2007, 246(1-2): 69-81.
［2］ Chang YL, Wu CT, Shih JY, et al. Roles of Fhit and p53 in Taiwanese surgically treated non?small?cell lung cancers［J］. Br J Cancer, 2003, 89(2): 320-326.
［3］ Galmarini CM, Kamath K, Vanier?Viornery A, et al. Drug resistance associated with loss of p53 involves extensive alterations in microtubule composition and dynamics［J］. Br J Cancer, 2003, 88(11): 1793-1799.
［4］ Nishizaki M, Sasaki J, Fang B, et al. Synergistic tumor suppression by coexpression of FHIT and p53 coincides with FHIT?mediated MDM2 inactivation and p53 stabilization in human non?small cell lung cancer cells［J］. Cancer Res, 2004, 64(16): 5745-5752.
