肺癌可溶性抗原与树突状细胞构建肿瘤疫苗的杀伤机制体外研究
作者：关晓海, 杨文凯, 伊雪, 李占清, 邬鹏宇 , 张宇,陈国生
【摘要】 目的：通过肺癌的可溶性抗原致敏的树突状细胞（DC）激活细胞毒性T细胞 (CTL)的杀伤作用各个环节的研究，初步探讨其作用机制及影响条件. 方法：从健康人外周血中提取外周血单核细胞（PBMC），加入GM?CSF和IL?4后，在第4日加入不同的促成熟因子，观察DC的表型变化及测定上清中的细胞因子情况. 通过DC表面HLA?DR的表达来比较不同抗原致敏DC的优劣. 应用不同浓度的肿瘤可溶性抗原（TSA），DC负载TSA的不同时间，不同活化时间的CTL及不同TAK与GLC?82细胞的效靶比来测定其中各种引起TAK最高杀伤活力的情况. 结果：DC较好的促成熟因子是MCM，第7日时达到高峰；TSA是较好的致敏DC抗原；最佳效靶比为1∶50. 结论：肺癌可溶性抗原是良好的DC致敏物，可在单核细胞条件培养基（MCM）协助下致敏并使DC成熟，表达更多的HLA?DR，高效激活T细胞.
【关键词】 树突状细胞
0引言
肿瘤的主动免疫一直是肿瘤治疗研究的热点. 树突状细胞(DC)是摄取、加工、呈递抗原的重要专职抗原呈递细胞，它呈递抗原的能力最强. 对如何在体内外通过刺激扩增和激活DC，提高其抗原递呈功能，以诱导特异性的细胞免疫反应等一系列以DC为手段的抗肿瘤免疫成为近年来的一大研究热点. 本实验就其各个环节的作用及机制作一初步探讨.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1主要试剂hGM?CSF，hIL?2， CD80?McAb， CD56?McAb， CE14?McAb抗人CD3?McAb（北京邦定公司） hIL?4，hTNF?α（美国PEPRO TECH公司） 鼠抗人CD1?McAb， 鼠抗人HLA?DR （北京中山公司） 羊抗鼠IgG抗体 （Sauta Cruz Bio? Tech公司）T淋巴细胞检测试剂盒(SAP法)， IL?12,IL?2,TNF?α,IFN?γ,ELISA检测试剂盒（美国ZYMED公司）.
1.2方法
1.2.1单核细胞条件培养基（MCM）的制备将直径100 mm的塑料培养皿在人丙种球蛋白（10 g/L）室温下包被备用. 取健康成人新鲜外周血经淋巴细胞分离液（FICOLL）密度梯度离心得到PBMC，调细胞密度为2×1010/L悬于完全培养基中，37℃, 50 mL/L CO2孵育2 h，洗去非黏附细胞，继续孵育24 h，收集培养上清即单核细胞培养基，经过滤、除菌于-20℃保存.
1.2.2人外周血DC的体外初步诱导取健康成人外周抗凝全血50 mL，Ficoll法获取PBMC,调细胞密度为3×109/L ，除去悬浮细胞及非贴壁细胞，加入终浓度为100 ng/mL的hGM?CSF，50 ng/mL的IL?4及含10 g/L FBS EPMI 1640完全培养基1 mL，隔日换液并保持细胞因子浓度不变，以备下一步实验使用.
1.2.3DC成熟实验于DC培养第4日，将TSAⅡ以终浓度50 ng/mL加入DC中培养，在培养第5日后得到的未成熟DC取其中4组，分别加入不同的促成熟因子：MCM（按体积比1∶3）、TSAⅡ（终浓度为20 mg/L）, TNF?α(100 μg/L), 对照组按照原浓度加入GM?CSF和IL?4培养，于孵箱培养48 h后分别收获DC细胞.
1.2.4肿瘤抗原的提取1∶3摩尔氯化钾(3 mmoL/L KCl)法和酸洗涤法提取人肺癌GLC?82细胞的表面可溶性抗原多肽.
1.2.5三种抗原成分致敏DC上述三种抗原成分分别加入培养4 d得到的未成熟树突状细胞中，TSAⅠ组，TSAⅡ组，酸洗涤抗原组，未加抗原对照组4组，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱中孵育4~6 h冲击致敏，然后于含单核细胞条件培养基和GM?CSF和IL?4的全培中继续培养72 h后分别收集细胞，每组细胞分别做HLA?DR法检测（用SABC法）抗原呈递分子表达变化.
1.2.6致敏DC诱导特异性CTL的不同活化时间对TAK细胞杀瘤活性的影响将SAⅡ致敏的DC与T细胞按1∶20混合培养9 d，分别于第1, 3, 5, 7, 9日收集TAK作为不同活化时间的效应细胞，分别再与靶细胞人肺腺癌GLC?82细胞按50∶1混合置于96孔培养板孵育12 h，每孔设3个复孔，同时设单独T细胞与单独靶细胞的对照组. 用MTT法测定杀伤率.
统计学处理: 数据用x±s表示，采用SAS 6.0软件进行方差分析检验，多重比较采用SNK?q检验.
2结果
2.1DC免疫分子表型的变化SABC免疫组化法检测各组DC免疫分子的表达情况见表1. MCM组对DC表型的影响更为明显，与其它组相比，差异具有统计学意义（P均小于0.05）,说明MCM促进DC成熟的能力极强.
表1不同促成熟因子对DC免疫分子表达的影响(略)
2.2肿瘤抗原致敏DC的抗原呈递分子表达情况TSAⅡ组相对于其它各组，在致敏DC的表型HLA?DR上，具有统计学意义（P均小于0.05, 表2).
表2GLC82细胞不同提取方法的抗原作用于DC后表面MHC分子的表达(略)
2.3在效靶比为50∶1时其杀伤活性高有统计学意义（P<0.05），而100∶1时杀瘤活性低，与50∶1两组间无统计学意义（P>0.05）,提示CTL（TAK）与GLC82的最适效靶比在50∶1左右(表3).
表3不同效靶比时的CTL对GLC82的杀伤活性(略)
3讨论
DC是最有效的专职抗原递呈细胞,在分化发育过程中有两个不同的阶段.未成熟的DC,具有很强的摄取处理抗原的能力,一旦发育为成熟的DC,捕获抗原的能力即丧失,成为能激活静息T细胞产生初次免疫应答的抗原递呈细胞. 在体内,DC含量较少,所以体外大量扩增纯化DC是研究的关键. 研究证明：外周血单个核细胞可作为DC的来源. GM?CSF和IL?4可诱导其前体细胞向DC分化,TNF?α则可促进其成熟［1-2］. 本实验提示：经单核细胞条件培养基处理后的树突状细胞免疫分子的表达已明显具有了成熟期树突细胞的特点：CD80的表达的百分比是未成熟的2～3倍，HLA－DR表达提高至3～4倍，实验结果说明单核细胞条件培养基是较好的树突状细胞促成熟因子，这将会很有利于临床. 人们曾尝试用各种方法使DC负载有效的抗原，都能取得一定的体外效果，但体内疗效仍有待证实［3］. 本实验用GLC?82细胞的可溶性抗原TSAⅡ致敏的DC能诱导同源T淋巴细胞活化增殖产生CTL，激活的CTL体外对GLC?82细胞具有高效而特异的细胞毒作用. 其机制为：DC诱导特异性淋巴细胞杀瘤作用的机制与该细胞受到TSA刺激后表面膜分子,尤其是MHC，共刺激信号分子及某些黏附分子(LEA?3)的表达增加密切相关. 一旦上述膜分子表达增加,DC的抗原递呈作用则大大增强,同时尚可分泌TNFα, IL?12等可溶性细胞因子,并通过刺激静止CD4阳性T细胞活化等途径扩大抗瘤免疫效应. DC作为一种专职APC,除通过MHCⅡ类分子限制性途径活化TH细胞外,尚可借助其MHCⅠ类分子在受TSA诱导后的表达增加而有效刺与激CD8阳性T细胞,且作用强于单核吞噬细胞［4-5］. 其中某些具体机制仍有待经一步探讨.
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