亚砷酸钠对血红素加氧酶-1诱导作用
【摘要】 目的 观察不同暴露剂量和时间下，亚砷酸钠（NaAsO2）对体外培养的牛主动脉血管内皮细胞（BAEC）中血红素加氧酶-1(HO-1)的诱导作用。方法 分别在0～15μmol/L NaAsO2暴露0～24h收集培养的BAEC细胞蛋白提取液中，用蛋白印迹(western blot）法检测HO-1蛋白的诱导产生量。结果 0～15μmol/L NaAsO2暴露能够显著诱导BAEC细胞HO-1蛋白产生增加，并且分别具有剂量-反应和时间-反应相关关系；2?5μmol/L NaAsO2暴露即可显著诱导产生HO-1蛋白。结论 HO-1蛋白的诱导表明砷介导的一种细胞应激反应；HO-1蛋白可以作为无机砷暴露的敏感性生物标志物之一，有利于深入研究无机砷暴露的生物剂量反应。
【关键词】 亚砷酸钠
长期慢性砷中毒可以引起砷性皮肤损伤、外周血管和心血管疾病以及皮肤癌和多种内脏癌〔1〕。血红素加氧酶(HO）是血红素降解的限速酶。其同工酶HO-1对于氧化应激十分敏感，能够被多种刺激和应激因素所广泛诱导〔2〕。该诱导作用被认为是机体对各种氧化应激刺激的一种适应性保护反应。而无机砷暴露能够引起多种培养细胞、以及人类和实验动物体内的氧化应激水平提高〔3〕。本研究应用体外培养的牛主动脉血管内皮细胞（BAEC),探讨亚砷酸钠（NaAsO2）对HO-1的诱导作用。
1 材料与方法
1?1 主要试剂及仪器 亚砷酸钠（NaAsO2，日本Wako公司）；胎牛血清培养液（DMEM-F12，美国Sigma公司）；成纤维细胞生长因子（美国Proprotech公司）；抗HO-1抗体（美国Sigma公司）；CO2细胞培养箱（日本Kendro公司）；低温离心机（日本Sakuma公司）；电泳仪与转膜装置（日本Atto公司）。
1?2 细胞培养 BAEC细胞（日本Dainippon制药公司），按Michel法〔4〕改良后培养。采用DMEM-F12培养基，添加成分包括10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，10U/ml肝素和5ng/ml成纤维细胞生长因子。37℃,5%CO2常规培养。0?25%胰蛋白酶乙二胺四乙醇二钠盐（EDTA）用于细胞传代。第4～7代细胞用于后续实验。80％融合后的细胞，用无血清DMEM-F12培养基处理12～16h用于正式实验。
1?3 细胞染毒 BAEC细胞用0,2?5,5，10，15μmol/L NaAsO2暴露6h，测定细胞内HO-1蛋白表达；分别用2?5和10μmol/L NaAsO2暴露0,2，6，12，24h,测定细胞内HO-1蛋白表达。
1?4 HO-1蛋白的蛋白印迹(western blot)分析 BAEC细胞暴露于不同剂量和／或时间的NaAsO2后进行western blot分析〔5〕。十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯胺凝胶的浓度为12%，蛋白进样量为20μg。特异性一次抗体为抗HO-1抗体（1∶1000稀释）。自显影胶片扫描后用Adobe photoshop 7?0?1软件处理输出，并应用图像分析软件ImageJ进行定量分析。各条带数值均与空白对照组比，蛋白相对水平。
1?5 统计分析 采用SPSS10?0统计软件进行单因素方差分析。
2 结果
2?1 不同剂量NaAsO2暴露诱导HO-1蛋白的表达（图1） 2?5，5，10，15μmol/L NaAsO2暴露6h，均能够显著诱导BAEC细胞HO-1蛋白产生增加，并且具有剂量-反应关系（P<0?01)。2?5～15μmol/L NaAsO2暴露诱导产生的HO-1蛋白量分别是对照组的3?91，5?87，5?99，7?29倍。
图1 不同剂量NaAsO2暴露诱导HO-1蛋白的表达（略）
2?2 不同时间NaAsO2暴露诱导HO-1蛋白的表达（图2） 2?5和10μmol/L NaAsO2暴露2h开始出现HO-1蛋白的诱导，6h的诱导作用十分明显，并可持续24h;2?5和10μmol/L NaAsO2暴露均具有时间-反应关系(P<0?01);2?5μmol/L NaAsO2暴露2～24h诱导产生的HO-1蛋白量分别是对照组的2?26，3?34，4?65，4?13倍；10μmol/L NaAsO2暴露2～24h诱导产生的HO-1蛋白量分别是对照组的1?69，4?96，6?95和6?27倍；低剂量2?5μmol/L NaAsO2暴露能够显著诱导产生HO-1蛋白，而10μmol/L NaAsO2暴露6，12，24h诱导产生的HO-1蛋白量分别显著高于对应时间的2?5μmol/L NaAsO2暴露（P<0?01）。
图2 不同时间NaAsO2暴露诱导HO-1蛋白的表达（略）
3 讨论
HO-1是一种应激反应蛋白，其诱导表达是机体对氧化应激等的一种适应性反应。无机砷通过活化NADPH氧化酶增加血管内皮细胞超氧阴离子自由基（O-2）和H2O2的产生〔3〕。NaAsO2暴露能够显著诱导血管平滑肌细胞HO-1蛋白和／或HO-1 mRNA表达，而过氧化氢酶、以及抗氧化剂二甲基亚砜和N-乙酰半胱氨酸能够降低该诱导作用〔6,7〕。本研究中，NaAsO2暴露对BAEC细胞HO-1蛋白的诱导很可能表现为砷介导的一种细胞应激反应。动物实验表明，NaAsO2是HO-1蛋白的强烈和特异性诱导剂，能够诱导大鼠和小鼠肝脏、肾脏HO-1高表达，十分敏感并与组织中的无机砷含量具有高度相关性〔8〕。Menzel等〔9〕报道，人类淋巴细胞中的HO-1蛋白诱导可以作为无机砷暴露人群的生物标志物。本研究表明，NaAsO2暴露能够引起BAEC细胞HO-1蛋白表达上调，且具有显著的剂量-反应和时间-反应关系；同时，2?5μmol/L NaAsO2暴露就能够显著诱导产生HO-1蛋白。结果表明，无机砷暴露对HO-1蛋白的诱导作用可以作为无机砷暴露的敏感性生物标志物之一，对于深入研究无机砷暴露的生物剂量反应关系提供。
（本研究得到中日川医学研究者奖学金的支持和日本筑波大学熊谷嘉人教授的指导，在此一并表示感谢!）
【参考】
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