正常和HBsAg阳性孕妇胎盘中TLR3检测分析
【摘要】 目的 了解Toll样受体(TLR3)在正常和HBsAg阳性孕妇胎盘各层细胞中的分布，探索TLR3在胎盘HBV感染中的作用。方法 免疫组织化学(SABC)法检测19例正常孕妇胎盘和102例HBsAg阳性孕妇胎盘组织中TLR3和HBsAg。结果 TLR3在正常孕妇胎盘阳性率100?00%(19/19)，HBsAg阳性孕妇胎盘阳性率74?51%(76/102)；102例HBsAg阳性孕妇胎盘发生乙型肝炎病毒(HBV)感染为33例；TLR3在正常孕妇胎盘和HBsAg阳性孕妇胎盘上的分布差异有统计学意义(χ2=6?17,P=0?012)；TLR3与胎盘HBV感染的关系差异有统计学意义(χ2＝13?581,P=0?0001)。结论 TLR3可能是HBsAg阳性孕妇胎盘发生HBV感染的一个保护因素(OR=0?180,95%CI=0?069～0?469)。
【关键词】 乙型肝炎病毒
人类的免疫系统可以分为先天性免疫和获得性免疫。先天性免疫系统作为防御病原体侵入的第一道防线反应迅速而非特异。最近研究发现，Toll样受体(Toll Like Receptors，TRL3)在先天性免疫系统中起着非常重要的作用［1］。目前在人体内已发现10种TLR，每一种都有其特异的识别配体，其中TLR3特异性的识别病毒dsRNA，在病毒感染的先天性免疫反应中起重要作用［2］。乙型肝炎病毒(HBV)在子宫内经胎盘引起的传播因无法用乙型肝炎(乙肝)疫苗加以阻断,危害十分严重，而正常胎盘防御微生物侵袭的过程也存在先天性免疫反应［3，4］。因此，本文通过研究TLR3在正常胎盘和HBsAg阳性孕妇胎盘的分布，来了解TLR3分布和胎盘HBV感染之间的关系。
1 对象与方法
1?1 对象 以2003年7月～2004年4月于太原市传染病院妇产科进行产前检查并分娩的HBsAg阳性孕妇102例和山西医科大学附属一院无妊娠并发症的足月产孕妇19例为研究对象。孕妇均为汉族，平均年龄27?12岁。
1?2 胎盘收集方法 胎盘于娩出后30min内切取胎盘完整厚组织约1cm×1cm×2cm大小，浸入4%多聚甲醛液中固定。
1?3 免疫组织化学(SABC)染色方法 胎盘组织经固定、常规石腊包埋后，进行5μm连续切片。然后应用SABC染色法进行检测，按试剂盒(武汉博士德公司)方法操作。鼠抗人TLR3(TLR3?7)(美国Santa Cruz公司)；鼠抗人HBsAg(美国Zymed公司)，批号分别为c0805和180023。苏木素?伊红(HE)染色。
1?4 对照的设置 阳性对照：病理科证实的HBsAg阳性的肝组织片；阴性对照：血清标志物阴性孕妇的正常胎盘组织；同时设空白对照和替代对照。而TLR3的检测只设空白对照和替代对照。
1?5 统计分析 采用SPSS 11?5软件进行χ2检验和趋势χ2检验。
2 结果
2?1 胎盘TLR3的分布情况 TLR3在19例正常孕妇胎盘各层细胞都有很强的免疫印迹，呈片状分布，以胞浆分布为主，也可见于胞膜和胞核上；TLR3在102例HBsAg阳性孕妇胎盘中，26例没有检测到阳性信号，76例可见阳性信号，胎盘蜕膜细胞阳性31例、滋养层细胞阳性47例、绒毛间质细胞阳性73例和绒毛毛细血管内皮细胞阳性76例，局灶性分布(图1，2)。TLR3在正常孕妇胎盘和HBsAg阳性孕妇胎盘分布差异有统计学意义(χ2=4?750，P=0?029)，而TLR3在胎盘各层细胞上的分布差异无统计学意义(χ2=7?189，P=0?066)。
图1 免疫组织化学法检测孕妇足月胎盘TLR3，蜕膜细胞胞浆棕黄色信号显示TLR3免疫组织化学(IHC)(HE，×200)（略）
2?2 胎盘HBV感染状况 观察期内所收集的102例胎盘中，有33例发生HBV感染。胎盘蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞均感染HBV，以胞浆分布为主，局灶性分布多见。
图2 免疫组织化学法检测孕妇足月胎盘TLR3，滋养层细胞、绒毛间质细胞和毛毛细血管内皮细胞胞浆棕黄色信号显示TLR3免疫组织化学(IHC)(HE，×200)（略）
2?3 胎盘TLR3分布与HBV感染关系 将102例HBsAg阳性孕妇胎盘按是否发生HBV感染分为胎盘HBV感染组和未感染组，分析胎盘TLR3分布与HBV感染关系。TLR3的分布在胎盘HBV感染组和未感染组差异有统计学意义(χ2=13?581，P<0?0001)。进一步分析胎盘各层细胞TLR3分布与HBV感染关系差异无统计学意义(表1)。
表1 TLR3与胎盘HBV感染的关系（略）
注：χ2=13?581(P<0?0001)，OR=0?180，95%CI=0?069～0?469
3 讨论
近几年先天性免疫的研究已经取得了巨大的进步，而Toll样受体一直是研究的热点。先天性免疫系统在人类生育过程中也起着至关重要的作用［3，4］，但是TLR3在人类胎盘分布的研究较少。本研究用SABC染色法检测TLR3在足月胎盘上的分布。结果显示，正常胎盘的各层细胞都有明显的免疫印迹，表明正常胎盘可能在防御病毒侵袭的先天性免疫系统中起着重要的作用。
本文结果显示，胎盘各层细胞TLR3分布与HBV胎盘感染关系的分级分析差异无统计学意义，但可看出从母面到胎儿面各层细胞的χ2值逐渐增大、OR值逐渐减小，TLR3分布逐渐增强，而且绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞与蜕膜细胞相比较差异有统计学意义，提示胎盘各层细胞TLR3分布与胎盘发生HBV感染的危险性可能呈剂量?效应关系，可认为TLR3在胎盘各层细胞HBV感染的作用均不可忽视。Rock FL等用Western blot研究结果显示，所有检测组织中TLR3mRNA在胎盘的表达最强［5，6］。本研究发现，TLR3和胎盘HBV感染有较强的负联系，OR=0?180，95% CI=0?069～0?469)，提示TLR3可能是胎盘HBV感染的一个保护性因素。HBV在其复制过程中生成dsRNA，而TLR3的配体为病毒的dsRNA［7，8］，可能是TLR3特异的识别了HBV复制过程中产生的dsRNA，从而引发先天性免疫反应，对机体产生有效的免疫保护。但由于母血病毒拷贝数较大，使胎盘TLR3耗竭出现失代偿从而引起胎盘HBV感染。进一步的证明还需体外实验的支持。
【】
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