重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究
【关键词】 胆囊肿瘤；血管抑素；抗血管生成；基因转染
Experimental study of antiangiogenic therapy with mouse angiostatin gene transduction in gallbladder cancer
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of mouse angiostatin gene transfected into gallbladder cancer cells, antiangiogenic activity of angiostatin protein and inhibitory effect of angiostatin on implanted gallbladder carcinoma of nude mice. METHODS: The recombinant vector pcDNA3.1(+)angiostatin was transfected into gallbladder cancer cells GBCSD with liposome lipofectamine2000. Angiostatin protein expression was examined by Western blot in the stable cell lines by G418 and its inhibitory effect on the vascular endothelial cells ECV304 was observed in vitro. The nude mice were divided into 2 groups: angiostatin group and control group implanted with GBCSD/pcDNA3.1(+)angiostatin cells and GBCSD cells respectively. The carcinoma volume and microvessel density (MVD) of each group were compared and analyzed. RESULTS: After 30 d of transfection and selection with G418, macroscopic resistant cell clones were formed. Western blot showed that angiostatin protein was expressed and secreted by GBCSD/pcDNA3.1(+)angiostatin cells. The angiostatin protein could inhibit the proliferation of vascular endothelial cells ECV304 dependent on bFGF (P<0.01). In addition, the nude mice experiment showed that tumorigenic capability of the GBCSD/pcDNA3.1(+)angiostatin cells had been reduced significantly (P＜0.01). Immunochemistry study demonstrated that MVD of the angiostatin group was lower than that of the control group (P＜0.05). CONCLUSION: Angiostatin gene transduction may have potential value in the treatment of gallbladder cancer in the future.
【Keywords】 gallbladder neoplasms; angiostatin; antiangiogenesis; gene transfection
【摘要】 目的：研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白，以及对裸鼠种植性胆囊癌生长的抑制作用. 方法：应用脂质体lipofectamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)angiostatin转染胆囊癌细胞株GBCSD，G418抗性筛选；以Western blot检测血管抑素的表达,以血管内皮细胞增殖分析检测其生物学活性，接种裸鼠并比较肿瘤体积和肿瘤微血管密度（MVD）. 结果：得到表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖(P<0.01)；血管抑素组裸鼠肿瘤体积小于野生细胞对照组(P<0.01)，免疫组化检测显示血管抑素组裸鼠肿瘤微血管密度（MVD）低于野生细胞对照组(P<0.05). 结论：血管抑素基因转染对裸鼠种植性胆囊癌的生长有抑制作用，这是血管抑素组肿瘤组织内新生血管形成受到抑制而减少所致.
【关键词】 胆囊肿瘤；血管抑素；抗血管生成；基因转染
0引言
胆囊癌预后极差,故积极探索胆囊癌的基因具有非常重要的意义.肿瘤的生长依赖于丰富的血供,通过抑制肿瘤新生血管形成就可以使肿瘤缺血坏死达到治疗目的.血管抑素(angiostatin)是1994年OReilly等［1］发现的能强烈抑制血管内皮细胞生长和新生血管形成的蛋白质.为此，我们拟应用重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒转染胆囊癌细胞株, 检测血管抑素的蛋白表达，并观察其对血管内皮细胞的作用和对裸鼠种植性胆囊癌生长的影响.探索血管抑素在胆囊癌血管抑制基因治疗中的意义.
1材料和方法
1.1材料E. coli DH5α菌和pcDNA3.1(+)由陕西省人民病毒室保存. 血管抑素angiostatin cDNA基因片断和兔抗HAtag多克隆抗体由第四军医大学西京医院张德新博士惠赠.基因测序：上海申友生物技术公司.脂质体lipofectamine2000，G418和DMEM培养基:Gibco公司.λdsDNA/HindⅢ标准物和各种限制性核酸内切酶:华美公司或New England Biolabs公司.质粒提取和胶回收试剂盒:上海华舜公司.Balb/c裸鼠：第四军医大学实验动物中心，SPF条件下饲养.胆囊癌细胞株GBCSD:中科院上海细胞生物学研究所，在含150 mL/L小牛血清、高糖DMEM培养液中，37℃，50 mL/L CO2条件下培养.血管内皮细胞系ECV304:第四军医大学口腔医院，在含100 mL/L胎牛血清、高糖DMEM培养液中，37℃, 50 mL/L CO2条件下培养.
1.2方法
1.2.1pcDNA3.1(+)angiostatin质粒构建和基因转染经酶切、 回收和连接将血管抑素angiostatin cDNA基因片断装入真核表达载体pcDNA3.1(+),转化、挑选抗性克隆和提纯质粒，经酶切鉴定和基因测序证实.连续培养胆囊癌细胞株GBCSD，脂质体lipofectamine2000基因转染，设置实验组（血管抑素组）pcDNA3.1(+)angiostatin 1.2 μg/脂质体3 μL,阴性对照组（空载体对照组）pcDNA3.1(+) 1.2 μg/脂质体3 μL,空白对照组脂质体3 μL.转染48 h后换用含筛选浓度新霉素G418 (400 mg/L)的选择培养液培养.1 wk后空白对照组细胞全部死亡，实验组和阴性对照组4 wk后均出现肉眼可见的细胞克隆，随机挑选抗性克隆，待细胞扩增后移至培养瓶用200 mg/L G418培养液扩大培养.另取野生GBCSD细胞为对照,同时测定该3组肿瘤细胞的体外生长曲线：用不含G418的150 mL/L小牛血清、高糖DMEM培养液培养，取对数生长期的细胞1×104接种于24孔培养板中,每日计数3孔中的细胞数绘制生长曲线.
1.2.2血管抑素的表达及生物学活性用Western blot法检测血管抑素的表达，无血清培养液培养细胞5 d，收集培养上清,用lysinesepharose纯化；120 g/L丙烯酰胺凝胶变性蛋白电泳SDSPAGE;用硝酸纤维素膜300 V恒压电转移2 h;按Western blot kit说明书操作:蛋白封闭液封闭膜30 min,一抗为兔抗HAtag多克隆抗体(1∶150),孵育40℃过夜;二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(1∶400),室温孵育1 h,DAB显色.用血管内皮细胞增殖分析法检测血管抑素的生物学活性:取对数生长期的ECV304细胞,用2.5 g/L胰蛋白酶,2 g/L EDTA消化后,用培养液(含100 mL/L FBS的DMEM)调细胞密度为1.0×108/L,接种于24孔板,每孔接种0.5 mL,于37℃,50 mL/L CO2条件下培养24 h,换用含1 μg/L bFGF的新鲜培养液,并加入含血管抑素的培养液上清继续培养24 h,进行MTT比色法检测,于570 nm处测其A值.对照组为空白载体转染的GBCSD胆囊癌细胞的培养液上清.
1.2.3裸鼠肿瘤生长体积测定将Balb/c裸鼠（鼠龄4~6 wk）11只随机分成2组，在裸鼠背部皮下注射1×1010/L对数生长期细胞悬液0.2 mL，血管抑素组6只，野生GBCSD细胞对照组5只，分别注射GBCSD/pcDNA3.1(+)angiostatin细胞和GBCSD细胞；观察30 d后处死荷瘤裸鼠，切取肿瘤并测量其长径a和短径b（单位mm），按公式1/2×ab2肿瘤的体积.
1.2.4肿瘤微血管密度（MVD）免疫组化将以上2组肿瘤标本制备成石腊切片，按SABC法进行免疫组化染色，一抗为兔抗鼠vWF mAb，工作浓度1∶200，二抗为1∶200稀释的辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG，经DAB显色，血管内皮细胞被染成棕黄色.盲法对染色结果进行评估，随机计数10个200倍视野下的血管数，取其平均值作为改只裸鼠肿瘤的MVD值，计算出同组裸鼠肿瘤的平均MVD值.
统计学处理： 用SSPS 12.0进行数据处理，t检验. P<0.05即认为有统计学差异.
2结果
2.1pcDNA3.1(+)angiostatin质粒构建和基因转染鼠源性血管抑素cDNA基因片段包括鼠纤溶酶原N端分泌信号肽(SS)、激活前肽(PA)、Kringle14(K14)和融合的流感病毒血凝素抗原标记肽(HAtag).酶切鉴定电泳结果显示XbaⅠ+HindⅢ双酶切和BamHⅠ单酶切载体pcDNA3.1(+)angiostatin后均释放出大小约1.4 kb的基因片段,且HindⅢ线性化载体大小约7.0 kb,符合预测结果(图1).进一步测序证实所得质粒上的目的基因碱基序列与GenBank上的序列(序列号为J04766)完全一致.阅读框架正确,HAtag的碱基序列为5′
图1－图2 略
2.2血管抑素的表达及生物学活性Western blot检测结果显示实验组即转染pcDNA3.1(+)angiostatin质粒的GBCSD细胞分泌上清中有Mr 58 000的目的蛋白表达.而野生GBCSD细胞和空载体转染的GBCSD细胞无此蛋白条带.进一步用ECV304细胞进行MTT试验,结果实验组为0.471±0.026,空载体对照组为1.099±0.051(P<0.01),证明实验组分泌的上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖,且这种作用是特异性针对内皮细胞的.显微镜下观察发现：实验组的ECV304细胞数量减少,细胞生长状况较差,细胞发生圆缩或脱落漂浮,形态发生改变,但仍然为贴壁细胞的状况.
2.3裸鼠肿瘤的体积接种后，野生细胞对照组1 wk时可见突出于皮下的肿瘤，瘤体生长相对较快；血管抑素组9 d皮下开始出现肉眼可见的小结节，肿瘤生长相对缓慢. 30 d时血管抑素组裸鼠肿瘤体积小于野生细胞对照组（mm3, 748.3±230.5 vs 1844.6±349.2, P<0.01).
2.4肿瘤MVD检测经vWF mAb免疫组化染色，血管内皮细胞染成棕黄色；血管抑素组裸鼠肿瘤微血管密度（MVD）低于野生细胞对照组（18.8±5.8 vs 31.2±9.0），有统计学意义(P<0.05).
3讨论
新生血管形成对于肿瘤的发生、生长和转移都是必需的,抑制这个过程就能抑制肿瘤生长.血管抑素(angiostatin)是1994年OReilly等发现的能强烈抑制血管内皮细胞生长和血管新生的Mr为38 000的蛋白质［1］，是纤溶酶原(plasminogen)的酶解产物, 包含纤溶酶原的前4个Kringle区，但完整的纤溶酶原不表现血管形成抑制活性.本实验所用的鼠血管抑素cDNA不仅包含纤溶酶原的前4个Kringle区,即第1a.a和第466a.a之间的片段，而且还含有激活前肽和HA标记肽的序列，因此，其在胆囊癌细胞中表达的目的蛋白的Mr（58 000）比OReilly等［1］最初报道的血管抑素的Mr（38 000）要大. 通过抑制血管新生来肿瘤成为攻克肿瘤的又一策略, OReilly等将这种疗法称为休眠疗法(dormancy therapy),即通过长期阻断血管形成来抑制恶性肿瘤的生长及转移［2］. 动物实验证实:此方法能抑制纤维肉瘤［3］、黑色素瘤［4］、胃癌［5］和肝癌［6］等肿瘤,具有无耐受性、无毒性、抑瘤谱广泛和易达靶细胞等优点,若能应用转基因方法将血管抑素基因转入靶细胞,使其自分泌和(或)旁分泌血管抑素,不仅可降低成本,还可在肿瘤局部造成药物的高浓度,增强治疗效果.
本实验应用脂质体lipofectamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)angiostatin转染胆囊癌细胞株GBCSD.实验结果表明, pcDNA3.1(+)angiostatin基因转染不直接抑制体外胆囊癌细胞的生长和增殖,但转染阳性质粒的GBCSD细胞可分泌血管抑素蛋白,且该蛋白具有抑制血管内皮细胞增殖的活性；裸鼠动物实验结果说明血管抑素基因转染对裸鼠种植性胆囊癌的生长有抑制作用，肿瘤微血管密度（MVD）检测结果进一步提示这种抑制作用是由于血管抑素组肿瘤组织内新生血管形成受到抑制而减少所致.初步显示,脂质体介导的血管抑素基因转染在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值.然而血管抑素在肿瘤细胞中的表达并未能完全阻止肿瘤组织内新生血管的形成和肿瘤的生长，原因可能有：本实验血管抑素的表达水平没有高到足以完全抑制肿瘤血管生成，另一方面肿瘤血管生成受多种抑制和刺激因子的调控. 因此，要真正地将血管抑素基因转染用于胆囊癌的治疗,尚有大量的科研和临床工作要做.
【】
［1］ OReilly MS, Holmgren L, Shing Y, et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma［J］. Cell, 1994,79(2):185-188.
［2］ OReilly MS, Holmgren L, Chen C, et al. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice［J］. Nat Med, 1996,2(6):689-692.
［3］ Cao Y, OReilly MS, Marshall B, et al. Expression of angiostatin cDNA in a murine fibrosarcoma suppresses primary tumor growth and produces longterm dormancy of metastases［J］. J Clin Invest, 1998,101(5):1055-1063.
［4］ Ambs S, Dennis S, Fairman J, et al. Inhibition of tumor growth correlates with the expression level of a human angiostatin transgene in transfected B16F10 melanoma cells［J］. Cancer Res, 1999, 59(22): 5773-5777.
［5］ Wu J, Shi YQ, Wu KC, et al. Angiostatin upregulation in gastric cancer cell SGC7901 inhibits tumorigenesis in nude mice［J］. World J Gastroenterol, 2003,9(1):59-64.
［6］ 陶开山，窦科峰. 重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达［J］. 第四军医大学学报， 2005， 26（18）： 1668-1672.
