鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒的稳定性及SPF雏鸡免疫试验

【关键词】  衣原体,鹦鹉MOMP；重组,遗传；腺病毒科；中和试验；雏鸡免疫

　　Stability test and SPF chick immune test of recombinant adenovirus containing major outer membrane protein  of Chlamydia psittaci of chicken origin

　　【Abstract】 AIM: To detect the stability of the recombinant adenovirus plasmid containing major outer membrane protein (MOMP) gene from Chlamydia psittaci in HEK293 cells, to evaluate whether cross reactivity exists  or not between recombinant adenovirus and positive serum of Egg Drop Symdrome (EDS), and to evaluate whether SPF chicks vaccinated with the recombinant adenovirus  were protected or not when challenged with virulent CpL strain. METHODS: The recombinant adenovirus plasmids were passaged in HEK293 cells in series and the target gene was detected by PCR. The recombinant adenovirus was mixed with positive serum of EDS in vitro and then infected HEK293 cells.  The SPF chicks were vaccinated with recombinant adenovirus and then challenged with the CpL strain. RESULTS: The target gene of recombinant adenovirus plasmid could be amplified by PCR in different passages of HEK293 cells. There was no cross reactivity between recombinant adenovirus and positive serum of EDS. 90% of the SPF chicks vaccinated with recombinant adenovirus were protected when challenged with the CpL strain. CONCLUSION: The recombinant adenovirus plasmid can be passaged stably in HEK293 cells. The recombinant adenovirus can not react with positive serum of EDS. The SPF chicks inoculated with the recombinant adenovirus vaccination are protected.

　　【Keywords】 Chlamydophilophila psittaci MOMP; recombination, genetic;  adenoviridae; neutralization tests;  chicks immunity

　　【摘要】 目的： 检测重组腺病毒质粒在HEK293细胞中的稳定性；重组腺病毒是否与减蛋综合征阳性血清发生中和反应，以及用重组腺病毒免疫SPF小鸡是否产生保护. 方法： 将重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代，并用PCR法检测目的基因；用减蛋综合征阳性血清在体外中和重组腺病毒，接种HEK293细胞；用重组腺病毒免疫SPF小鸡，然后用CpL菌株攻击. 结果： 重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代后，仍然用PCR检测能检测出目的基因；重组腺病毒与减蛋综合征阳性血清之间无交叉反应；用重组腺病毒免疫SPF鸡，用CpL菌株攻击，90%的小鸡获得了保护. 结论： 重组腺病毒质粒在HEK293细胞中能稳定传代；重组腺病毒不受减蛋综合征阳性血清的影响；用重组腺病毒免疫SPF小鸡，能够获得保护.
 
　　【关键词】 衣原体，鹦鹉MOMP；重组，遗传；腺病毒科；中和试验；雏鸡免疫

　　0引言
　　
　　禽衣原体病是由嗜性鹦鹉热衣原体感染禽类而引起的一种疾病. 目前该病被称为“鹦鹉病”或“鹦鹉热”，该病最早被认为与鹦鹉以及与这些鹦鹉接触的人相关联. 鹦鹉热衣原体由8个血清型组成. 这些血清型是通过使用血清特异性单克隆抗体直接免疫荧光试验［1］或通过PCR核苷酸序列分析或限制型片断长度多态性分析（RFLP）被鉴定出来［2-3］. 至少有6个血清型（A~F）被认为在家禽中流行. 　　鹦鹉热衣原体感染大部分宠物鸟、家禽（包括火鸡、鸭、鹅、鸡以及相关的家养品种）和野鸟［4］. 在家禽中，大爆发也经常发生在火鸡场和鸭场，并且导致人的感染［5-8］.
    
　　目前国内外尚无商业化疫苗预防禽衣原体病，而化药防治本病存在成本高、食品安全隐患等系列问题. 因此，为了控制本病，保护人类健康，促进养禽业的，研究和开发高效、低廉的疫苗势在必行. 本研究将构建的重组腺病毒质粒免疫SPF小鸡，获得良好的结果，为进一步的免疫试验奠定了基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料人胚胎肾细胞（HEK293）由兰州兽医研究所病毒室刘在新研究员提供；DMEM, RPMI1640培养基购自Gibco公司；重组腺病毒质粒由本室构建并鉴定［9］；胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司；植物血凝素（PHA）购自北京博大泰克生物科技有限公司；7日龄SPF小鸡购自甘肃省中医学院.
 
　　1.2方法

　　1.2.1重组腺病毒与减蛋综合征阳性血清的中和试验鸡减蛋综合症病毒（EDSV）为腺病毒，因此有必要用减蛋综合征阳性血清检测是否对重组腺病毒有抑止作用. 聚体操作步骤如下：取反复冻融的重组腺病毒HEK293 细胞液1 mL，进行10-1, 10-2……10-11系列稀释. 将购买的减蛋综合征阳性血清置56℃水浴中，灭活30  min. 取稀释的重组腺病毒HEK293细胞液100 μL，加入灭活的减蛋综合征阳性血清100 μL, 37℃作用1 h. 将中和液加入到已长满的HEK293细胞单层，37℃, 50 mL/L的CO2条件下培养，观察结果. 同时作对照.
 
　　1.2.2重组腺病毒稳定性试验将重组腺病毒连续传代20代以上，观察并记录细胞病变时间. 取第5代、第10代、第15代、第20代病变细胞，反复冻融3次. 取1 mL的冻融液，加入50 μL 100 g/L SDS和3 μL（20 μg/μL）, 60℃作用30 min，然后置37℃作用2 h. 提取腺病毒基因组DNA，进行PCR检测.
 
　　1.2.3重组腺病毒电镜观察取于36 h内病变的细胞，反复冻融3次，取2 mL 3000 r/min离心30 min，除去细胞碎片. 将磷钨酸配置成20 g/L的溶液，以1 mol/L的氢氧化钠调整pH为6.8，滤过后盖紧瓶盖，4℃保存. 将染液与病毒液等量混合后，在无菌柜或防尘罩内用喷雾器将样品喷到带膜的载网上，待干燥后进行电镜观察.
 
　　1.2.4重组腺病毒制备免疫用重组腺病毒AdMOMP为第21代毒，其毒价为3.4×1013 TCID50/L. 收集于30 h内病变的HEK293细胞，用PBS重悬，反复冻融3次，6000 r/min离心30 min，收取上清，直接用于小鸡免疫. 空白对照HEK293细胞悬液、野生型腺病毒Ad5的制备方法同上.
 
　　1.2.5CpL鸡胚适应毒CpL菌株在7 d龄鸡胚测定其毒力，毒力为2.8×1011.
 
　　1.2.6试验动物及分组试验动物为7日龄SPF雏鸡，共60只，分重组腺病毒组、野生型腺病毒组、HEK293细胞组，经翅根肌肉和皮下两个途径进行接种，每组10只，接种量分别为： 7.7×109 TCID50,  4×108 TCID50和0.4 mL.

　　1.2.7血清抗体效价测定于接种前1日和免疫后15 d，分别于试验鸡翅根部静脉采血，用衣原体间接血凝（IHA）试验检测血清衣原体抗体. 操作步骤如下： 取经处理过的干净的96孔V型板，每孔加入25 μL的稀释液. 取25 μL析出的血清，加入到第一孔中，混匀，吸取25 μL，加入到下一孔，如此对倍稀释，直至第7孔，混匀后吸弃25 μL. 同时作对照. 每孔加入抗原致敏红细胞25 μL，在振荡器上轻轻振荡1 min. 置室温下2～3 h，观察并记录结果.
 
　　1.2.8攻毒保护试验免疫后21 d，经翅根肌肉免疫的小鸡用分离株CpL进行攻击，攻毒量为0.2 mL（5.6×1010 ELD50），攻毒途径为鼻内接种. 攻毒后逐日观察，记录发病情况.

　　2结果

　　2.1重组腺病毒减蛋综合征阳性血清中和试验将重组腺病毒HEK293细胞反复冻融，系列稀释后与减蛋综合征阳性血清作用，接入已长满HEK293细胞的96孔细胞培养板，37℃, 50 mL/L的CO2条件下培养培养2~6 d，对照组只接入系列稀释的减蛋综合征阳性血清(表1).

　　表1重组腺病毒减蛋综合征阳性血清中和试验（略）

　　［注］A, B, C, D, E, F为试验组, G, H为对照组.  “+”表示有细胞病变，“-”表示无细胞病变.

　　从表2中可以看出，减蛋综合征阳性血清对重组腺病毒没有中和作用.
 
　　2.2重组腺病毒稳定性检测取第5代、第10代、第15代、第20代重组腺病毒，提取腺病毒DNA，进行PCR扩增，扩增产品用8 g/L的琼脂糖凝胶电泳观察(图1). 所选择的代次均扩增出了与预期大小一致的片段，说明重组腺病毒质粒中均含有禽源鹦鹉热衣原体MOMP基因，重组腺病毒质粒比较稳定.

　　M: DL2000 marker; 1~4: 第5代、第10代、第15代、第20代重组腺病毒PCR产物.

　　图1重组腺病毒稳定性测定（略）

　　2.3重组腺病毒电镜观察通过对HEK293细胞反复冻融，进行病毒分离、染色、电镜观察，病毒的直径大约为80 nm，呈六边形，与腺病毒相似，说明产生的细胞病变是由腺病毒感染而引起的(图2).

　　图2重组腺病毒电镜观察（略）

　　2.4免疫前的鹦鹉热衣原体抗体水平用兰州兽医研究所生产的衣原体IHA试剂盒对7 d龄小鸡衣原体血清抗体进行检测，随机抽样，结果根据IHA的判定标准，供试的雏鸡在免疫前无衣原体感染，可以用于试验.
 
　　2.5免疫后血清抗体的测定免疫后15, 21 d采血，测定出抗MOMP血清抗体(表2). 从免疫后15 d和21 d的血清抗体来看，15 d时血清抗体平均达到1∶6.96，而这时的血清抗体还没有达到保护水平（1∶16）. 对21 d抗体水平进行检测发现，小鸡的血清抗体平均达到1∶27.85，达到了相应的保护水平.
 
　　2.6肌肉免疫和皮下免疫抗体水平比较通过两种途径对小鸡进行免疫，在15 d和21 d分别采血，用衣原体IHA分别对两组进行抗体检测，检测结果表明，二者产生抗体的水平基本一致.
 
　　表2免疫后各组SPF小鸡的衣原体抗体检测情况（IHA法）（略）

　　2.7攻毒保护试验野生型腺病毒免疫组、HEK293细胞免疫组用CpL菌株攻击后6 mo开始发病，部分产蛋鸡产软壳蛋，产蛋率下降. HEK293免疫组有1只鸡死亡，剖检肝脾肿大，心包积液，输卵管囊肿. 将野生型腺病毒免疫组和其他HEK293细胞免疫鸡全部处死，剖检，全部出现肝脾肿大，部分鸡心包积液，部分鸡肺部有纤维素性渗出，部分鸡输卵管肿胀，但没有观察到有结膜炎的现象.
 　　
　　重组腺病毒免疫组除1只出现肝脾肿大外，其他9只剖检肝脾正常，无肿大现象. 产蛋鸡输卵管正常，并且无畸形蛋、软壳蛋(表3).

　　表3雏鸡攻毒保护试验（略）

　　3讨论
　　
　　在本试验中，重组腺病毒疫苗免疫途径采取了皮下注射和肌肉注射两个途径，来确定哪一个途径更为有效，从试验的结果来看，二者在重组腺病毒刺激机体产生抗MOMP抗体和T淋巴细胞方面没有多大的区别，这为后来的免疫试验及田间免疫提供了依据.
 　　
　　从免疫后15 d所测的血清抗体来看，抗体水平较低，可能与免疫的早期产生IgM有关，在理论上IgM的抗原结合价为10价，但与大分子抗原结合时，由于受到空间结构的限制，实际上只表现出5价有效［10］.  21 d测定抗体水平时，平均水平已上升到1∶27.85，个别小鸡抗体水平达到1∶64.
 　　
　　EDS疫苗是鸡场的常用疫苗之一，因此，种鸡携带EDS抗体的现象十分普遍. 用EDSV试剂盒抗原检测重组腺病毒抗体，来判断二者之间是否存在抗原抗体反应，若二者之间发生反应，说明EDSV与重组腺病毒之间具有相同的抗原位点，致使带有减蛋综合征母源抗体的小鸡免疫失败，使重组腺病毒活载体疫苗的使用受到限制. 从检测的结果来看，二者之间不存在抗原抗体反应. 所以该重组腺病毒活载体疫苗既可以用于带有减蛋综合征母源抗体的雏鸡，也可以用于EDS疫苗免疫过的鸡群.
 　　
　　鹦鹉热衣原体可感染100多种禽鸟. 持续性感染可存在几个月，几年是很正常的. 禽感染鹦鹉热衣原体强毒株后表现为精神萎顿、不食，眼和鼻有粘性分泌物，腹泻，后期脱水，消瘦. 剖检肝脾肿大，气囊发炎，纤维素性心包炎. 有的有严重的肠炎病变. 但鸡对衣原体表现出一定的抵抗力［11］. 在本动物试验中，攻毒后对照鸡没有表现出眼和鼻有粘性分泌物，但表现出轻度的腹泻，生长缓慢的症状. 到6 mo后个别鸡死亡，其他鸡处死后剖检，可见肝脾肿大，心包积液，肺部纤维素性渗出，部分鸡卵巢肿大，输卵管囊肿. 这与国内报道小鸡感染衣原体大约为15～50日龄，死亡率达20%～30%不相符［12］. 免疫组除1只鸡未获得保护外，其他9只鸡剖检肝脾大小正常，输卵管无肿胀. 说明，用该重组腺病毒疫苗免疫鸡产生了良好的保护效果.

　　【】

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