用线性动力学方法表征L苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用

【摘要】  目的：考察用线性动力学方法表征L?苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶抑制作用的可靠性. 方法：测定碱性磷酸酶水解对硝基苯酚磷酸酯（PNPP）的产物生成初速度. 用两个底物浓度下标定比活性米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm), 再据二者对抑制剂浓度的响应确定抑制剂类型和抑制常数. 结果：双倒数分析法重复测定发现70％的Km和Vm随抑制剂浓度升高而同步下降，两动力学参数变化对应抑制常数的比值为(2.4±0.6, n=9). 线性动力学方法所得参数精度稍高，Km和Vm随抑制剂浓度升高同时下降的出现率约80％，两抑制常数之比为(2.0±0.8, n=10)，两参数变化对应的抑制常数及两抑制常数之比都与双倒数分析法一致. 如允许两抑制常数之比在2.5倍内波动，则两种方法都表明L?苯丙氨酸为此碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂. 结论：此线性动力学方法可用于表征反竞争性抑制剂.

【关键词】  L?苯丙氨酸；反竞争性抑制；碱性磷酸酶；线性动力学方法；抑制常数

　　0引言

　　反竞争性抑制剂用作临床药物有明显优势［1-2］. 寻找反竞争性抑制剂需测定酶动力学参数（Km和Vm）对抑制剂浓度的响应以确定抑制类型及对应的抑制常数Kiv和Kik ［2-3］. 用双倒数分析法测定动力学参数寻找反竞争性抑制剂时需用从远低于Km到远高于Km范围内的底物浓度. 常规定量方法灵敏度有限，在很低底物浓度下测定初速度可靠性差，这限制了用常规定量方法和双倒数分析法筛选反竞争性抑制剂.  此前发现线性动力学方法只用高于Km的两个底物浓度也能表征竞争性抑制剂［4-5］. 用较高底物浓度有利于用常规方法定量测定初速度. L?苯丙氨酸对大鼠小肠黏膜碱性磷酸酶为反竞争性抑制作用［6］. 我们以兔小肠黏膜碱性磷酸酶为模型，考察此线性动力学方法表征L?苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶抑制作用的可靠性.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　2amino?2methyl?1propanol (AMP，美国Fluka公司)；L?苯丙氨酸（美国Amresco公司）；对硝基苯酚磷酸酯（美国Sigma公司）；其余为常规国产试剂. 成年大白兔8只，雌雄不拘（本校实验动物中心）. 新茂UV 7504分光光度计.

　　1.2方法

　　1.2.1碱性磷酸酶制备

　　［7］将8只大白兔小肠黏膜用250 mL生理盐水制成匀浆，1.0 mol/L  NaOH调到pH 7.5；四层纱布过滤，4℃下1800 g离心40 min；上清用2.0 mol/L醋酸钠(pH 3.8)调至pH 5(出现白色沉淀)，4℃静置过夜再1800 g离心40 min；沉淀用150 mL生理盐水溶解，0.5 mmol/L Na2CO3调到pH 7.5. 再离心、调到pH 5后收集沉淀，用100 mL冷蒸馏水溶解，冰水浴中缓慢加入40 mL正丁醇，38℃水浴5 min，离心收集下层无色水液约100 mL，搅拌下缓慢加(NH4)2SO4粉末100 g后过夜，离心收集水相和有机相间黏稠状不溶物，用pH 9.8的AMP溶解，离心去沉淀后-10℃保存. 临用前融化后用pH 9.8的AMP缓冲液稀释.

　　1.2.2碱性磷酸酶反应

　　监测缓冲液为100 mmol/L AMP?HCl（pH 9.8），其它试剂均用此缓冲液配制. 用13.6 (mmol/L)-1·cm-1的消光系数，据酶完全作用后的产物量标定对硝基苯酚磷酸酯浓度. 酶反应体系总体积2.0 mL，加底物启动反应40 s后，在2.0 min内且底物消耗<6％时段的平均速度为初速度. 用0.12 mmol/L底物标定酶活性，换算成酶活性单位数(nkat).

　　1.2.3抑制类型和抑制常数确定线性动力学方法

　　所用低浓度底物(SL)为0.070 mmol/L，高浓度底物(SH)为0.280 mmol/L，酶量为适当稀释的碱性磷酸酶液(<1.33 μkat/L) 30, 40, 50, 60 μL. 线性回归得两底物浓度下每10 μL酶液的比活性，用相关系数大于0.99的比活性数据计算Km和Vm［4-5］. 用双倒数分析法时所用底物浓度为0.018, 0.036, 0.072, 0.108, 0.144 mmol/L，适当稀释酶液50 μL. 两种方法所用苯丙氨酸都小于7.0 mmol/L. 据1/Vm和1/Km对抑制剂浓度响应的有效性、两抑制常数比值确定抑制剂类型和对应的抑制常数.
    
　　统计学处理：以回归分析有统计学显著意义的数据用于后续分析. 结果用x±s表示，用SAS 8e进行统计分析，t检验比较均值，F检验比较变异系数，χ2检验比较Km和Vm各种变化特征的出现率，P<0.05为差异显著.

　　2结果

　　2.1双倒数分析法

　　表征L苯丙氨酸的抑制作用无抑制剂时双倒数分析得兔小肠黏膜碱性磷酸酶Km为(73±7) μmol/L (n=13)；所用苯丙氨酸浓度下Vm变异系数小于10％，优于测定Km的精度. 用双倒数法13次重复测定抑制作用，发现近70％的Km随抑制剂浓度升高而显著降低，其余Km对抑制剂无有效响应；仅1次所得Vm对抑制剂无显著响应，其余Vm随抑制剂浓度升高而显著降低；Km和Vm随抑制剂浓度升高而同步降低者接近70％，Kiv/Kik为(2.4±0.6, n=9)，大于1.0 (t检验，P<0.001). 两参数都下降时所得Kiv/Kik都大于1.1但小于3.5，其中小于2.0者约30％，小于2.5者约80％.

　　2.2线性动力学法表征

　　L苯丙氨酸的抑制作用相同抑制剂浓度下线性动力学法所得Km与双倒数分析法一致，测定Vm的精度也优于测定Km(表1). 此法重复测定13批次，仅1次所得Vm对抑制剂浓度无显著响应，其余Vm随抑制剂浓度升高而显著降低；所得Km中80％随抑制剂浓度升高而显著降低，其余Km对抑制剂浓度无显著响应；两参数随抑制剂浓度升高同时下降出现率约80％，所得Kik和Kiv与双倒数分析法对应结果一致（表2）. 此法测定Km精度略优于双倒数分析法，其Kiv/Kik为(2.0±0.8) (n=10)，也大于1.0 (P<0.01)且与双倒数分析法一致(P>0.19)；所得Kiv/Kik都大于1.1而小于3.9，其中小于2.0者占70％，小于2.5者占80％. 此法所得Km和Vm中任一个随抑制剂浓度升高而显著下降、二者随抑制剂浓度升高同时显著下降这三种情况的出现率都与双倒数分析法无显著差异（χ2检验，P>0.658）.表1两种方法测定兔小肠黏膜碱性磷酸酶Vm和Km(略)
表2两种方法所得Kiv，Kik及Kiv/Kik的比较(略)

　　3讨论

　　反竞争性抑制剂同时降低米氏酶的Km和Vm且改变Km和Vm的效力应相当，即Kiv与Kik比值应接近1.0［8］. 双倒数分析法所得Km和Vm同时降低者达到70％，但如要求1/Km和1/Vm对反竞争性抑制剂浓度变化响应的两个抑制常数比值小于1.10，则双倒数法的结果表明苯丙氨酸对此酶只能属于混合型抑制剂，不可能为反竞争性抑制剂. 不同方法测定Km精度都比测定Vm精度低，实践中所用抑制剂浓度范围也有限，这些都会降低据Km和Vm变化所得两个对应抑制常数的可靠性，使得二者的比值存在较大波动. 模拟分析发现即使双倒数分析法的随机误差很小，如只允许两个抑制常数的比值在1.1倍内波动，则反竞争性抑制剂被误定为其它抑制剂的比例可达80％以上；当允许其比值在2.0倍范围内波动时，确定反竞争性抑制剂的准确度可提高到75％左右(数据待发表). 因此，考虑到实验误差的影响，设定反竞争性抑制剂对应Kiv/Kik的临界值为2.0，则线性动力学法表明苯丙氨酸最可能是兔子小肠黏膜碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂，而双倒数分析法表明苯丙氨酸可能是此碱性磷酸酶的混合型或反竞争性抑制剂. 设定此临界值为2.5则两种方法一致表明苯丙氨酸为此碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂. 可见，考虑到实验误差的影响允许两个动力学参数变化对应抑制常数比值在较大范围内波动，则两种方法都表明苯丙氨酸可能是兔小肠黏膜碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂，且此线性动力学法对应的两个抑制常数比值波动范围更窄，结果可靠性可能更高.

　　竞争性抑制剂会升高Km，此线性动力学法表征竞争性抑制剂时需较高的底物浓度才能在有抑制剂时使预设SL仍在Km 的0.8倍以上，但底物浓度过高会降低测定竞争性抑制剂的灵敏度. 反竞争性抑制剂会降低Km，将SL定为无抑制剂时Km的0.8倍以上而SH为SL的4倍时可保障满足此线性动力学法的要求，且用较高底物浓度可提高测定反竞争性抑制剂的敏感性. 另外，此线性动力学法仅用较高底物浓度有利于用常规方法定量测定初速度. 但设定所需的两个底物浓度后，此线性动力学法所允许的酶Km变化范围仍然有限［4-5］，测定竞争性或反竞争性抑制作用时还需优化所用抑制剂浓度. 非竞争性抑制剂不改变酶Km，使得此线性动力学用于筛选非竞争性抑制剂的可靠性更有保障. 综上所述，在靶酶Km过低或定量方法灵敏度有限时，此线性动力学方法有利于用常规定量方法快速筛选米氏酶的常见类型抑制剂，且用于发现反竞争性抑制剂可能还有一定优势.

【】
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