温敏性壳聚糖/β?甘油磷酸二钠盐水凝胶的初步研究
【摘要】 目的 探讨温敏性壳聚糖/β?甘油磷酸二钠盐水凝胶应用于软骨再生的可行性。方法 制备壳聚糖/β-甘油磷酸二钠盐水凝胶。将体外培养的小鼠软骨细胞与水凝胶共培养，采用荧光倒置显微镜观察细胞在三维材料上生长分布的状态。选取共培养1、2周的细胞/水凝胶复合物，采用RT?PCR半定量的方法，检测Ⅱ型胶原和聚合素两种细胞外基质在mRNA转录水平上的差异。结果 制备的水凝胶具备生理性的pH值，在常温下为液态，体温状态下为胶冻状。荧光倒置显微镜显示共培养2周时软骨细胞呈球状生长。细胞/水凝胶复合物共培养2周后，Ⅱ型胶原和聚合素的合成增加。结论 壳聚糖/β?甘油磷酸二钠盐水凝胶具有温度敏感性，是一种生物相容性的温固化凝胶。
【关键词】 壳聚糖；β?甘油磷酸二钠盐； 温度敏感材料
ABSTRACT：Objective To investigate the feasibility of novel thermally sensitive chitosan/β-glycerophosphate (Ch/GP) hydrogel for chondrocytes regeneration. Methods Ch/GP hydrogels were prepared. Fluorescent inverted microscopy (FIM) was used to show the cellular proliferation and three?dimensional distribution in the hydrogels. The expression of were collagen type Ⅱ and aggrecan detected with RT?PCR. Results These formulations possess a physiological pH and can be held liquid below room temperature for encapsulating living cells; they form monolithic gels at body temperature. FIM shows that at 2 weeks, the cells are generally round. In addition, we found that the normalized ratio of collagen type Ⅱ and aggrecan significantly increased at 2 weeks, as compared to that at 1 week(P<0.05). Conclusion This study reports for the first time the use of Ch/GP aqueous solutions as gelling systems, suggesting the discovery of a prototype for a new family of thermosetting gels highly compatible with biological compounds.
KEY WORDS：Chitosan; β?glycerophosphate; Thermally responsive material
关节炎或者运动损伤造成的关节软骨变性能影响各个年龄层次的身体健康。关节软骨的营养仅来自于关节滑液,无血液、淋巴循环,亦无神经支配,损伤后其自身修复能力较差,关节软骨的缺损修复一直是临床上尚未解决的难题。水凝胶是亲水的聚合物,它能够吸收大量的水分,但由于聚合物链间的物理交联和化学交联作用而不会溶解于水中,只能溶涨且保持一定的形状[1]。最低临界温度介于室温和体温之间的温度敏感性水凝胶因其在组织再生[2-4]、细胞传递和细胞[5-8]方面的应用日益受到人们的关注。温度敏感性水凝胶非常适合用于关节软骨再生，因为它高度含水的三维网络结构能够为细胞增殖，迁移和分化提供良好的微环境，并能引导宿主细胞的长入。
最近我们发现用具有相反电荷的多羟基盐例如β?甘油磷酸二钠盐（β?glycerophosphate，GP)中和后的壳聚糖（chitosan，Ch）具备温度敏感性。这种溶液能够在室温或者低于室温的状态下较长时间的保持液态，当温度上升到37℃，溶胶则转换成凝胶状态，并且其pH值维持在生理范围6.8～7.2。本试验的目的就是研究Ch/GP温固化系统的物理特征，为软骨再生的细胞治疗的可行性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
壳聚糖（高分子量，脱乙酰度>95％），β?甘油磷酸二钠盐（Sigma公司），培养液（DMEM）和胎牛血清（Gibico公司）。其他试剂均为分析级。
1.2 制备chitosan/GP复合凝胶
将壳聚糖粉剂200mg溶解于10ml 0.1M的乙酸溶液中，边添加边用磁力搅拌器搅拌，至少1h。溶解完全后高温高压消毒20min。将GP粉剂溶解于去离子水（45％，w/w）后过滤消毒。冰浴15min后，将冷的GP溶液逐滴滴加到冷的壳聚糖溶液中，边滴加边轻轻摇晃。混合完全后壳聚糖和GP的终浓度分别为1.8％和7.3％（w/v）。
1.3 软骨细胞分离培养、包裹及观察
断颈法处死4周龄的BALB/c小鼠，重量约20～30g，无菌环境下剥离并切碎软骨组织，0.2%胶原酶消化2h后离心收集，用含有10％的胎牛血清、100U/ml 青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM重悬，置于37℃的细胞培养箱中培养。当原代培养成功细胞生长增殖形成单层细胞后，进行传代培养。在冰浴的环境下，传至4～5代的细胞用纯的胎牛血清重悬后逐滴与Ch/GP溶液混合，使细胞的密度达约106个/ml。将混合溶液小心倾倒入无菌的6孔板中，在37℃的细胞培养箱中培养30min使其完全凝固，然后添加含有10％的胎牛血清的DMEM继续培养,每3天换液。对培养1、2周的细胞/水凝胶复合物进行荧光倒置显微镜观察。采用免疫荧光染色方法处理标本，即刻观察并照相。
1.4 逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）
选取共培养1、2周的细胞/水凝胶复合物，采用RT?PCR半定量的方法，检测Ⅱ型胶原和聚合素（aggrecan）两种细胞外基质在mRNA转录水平上的差异。
2 结 果
2.1 Ch/GP一般特征
壳聚糖稀盐酸溶液呈淡黄色粘稠状透明液体，pH值5.6；GP水溶液呈无色透明液体，pH值9.7。随着GP溶液的逐滴滴加，壳聚糖溶液逐步变得清亮透明，混合后pH值为6.8,具有适合细胞体外培养的酸碱环境。37℃下凝固时间为15min，较好的满足可注射支架材料的要求，适宜细胞存活，方便术中操作。Ch/GP凝胶大体观呈半透明瓷白色，触压有一定的韧性。
2.2 软骨细胞在Ch/CMC凝胶中的三维培养
细胞在凝胶中生长、分布情况如图1所示。细胞定植在凝胶中，视角聚集到凝胶的不同层面可见软骨细胞呈三维较均匀分布。培养2周（图1）的细胞－水凝胶复合物用AO染色，荧光倒置显微镜下观察可见软骨细胞仍保持球形，视角聚集到凝胶的不同层面可见软骨细胞呈三维较均匀分布。
3 讨 论
组织工程的出现和微创手术的，使可注射性组织工程软骨的研究日益受到关注。与固态支架材料相比，可注射性的生物材料具有可以与细胞均匀混合，与修复组织之间嵌合连接好，塑型容易的特点，且能通过关节镜操作，简单、安全、有效，适应微创手术理念。
用于可注射性软骨的载体材料众多，有蛋白纤维凝胶、藻酸钙凝胶、透明质酸、聚氧化乙烯酸、二甲基丙烯、聚氧化丙烯等。与上述凝胶支架相比，壳聚糖不仅具有良好的生物相容性、降解性，还具有抗菌、止血、止痛，预防膝关节或肌腱粘连，延缓创伤性关节软骨退变等作用。其理化性质和临床应用与透明质酸有许多相似之处，如促进软骨细胞再生，维持软骨细胞分化表型，诱导软骨特有基质蛋白的mRNA表达，产生Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原和蛋白多糖。壳聚糖的降解产物可作为关节液中的硫酸角质素、硫酸软骨素及透明质酸的合成原料，是关节软骨的重要营养物质[9]。研究发现[10]医用壳聚糖与透明质酸钠加入林格氏液中制成关节灌注液，关节软骨超微结构结果表明，它能比林格氏液更好地保护关节软骨。本实验中所用凝胶中壳聚糖部分能否起到相似的作用，还有待以后的深入研究，不过凝胶具有维持细胞表型和分泌软骨基质的作用是肯定的。
壳聚糖只能溶解于酸性溶液，β?甘油磷酸二钠盐的加入将壳聚糖溶液改造成温固化的溶液。其凝固温度与壳聚糖分子量无关，与脱乙酰度成负相关。因此，可通过选择不同脱乙酰度的壳聚糖来控制凝胶的凝固温度和时间。凝胶复合物还可以作为细胞因子或药物大分子的缓释体系，通过调整其体内降解速度，制成可控制释放大分子速度的载体物质。
体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ 型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、pH细胞的接种密度、血清浓度、氧分压及培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以反分化或向肥大软骨细胞转化。 体外培养只有维持其正常形态才能保持其正常功能。本研究将软骨细胞移植于Ch/GP进行三维体外培养， 2周后其细胞数扩增，且细胞产生蛋白多糖(聚合素)和Ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养有利于维持其形状。
我们的试验初步证实脱乙酰度90％以上的壳聚糖稀盐酸溶液和β?甘油磷酸二钠盐水溶液混合后，pH值在人体生理范围，室温下保持液态，置于37℃，15分钟内形成凝胶，能满足可注射性组织工程支架的术中操作要求。至于凝胶?细胞复合物直接注射关节缺损部位，能否满意填补缺损，保持细胞存活并发挥软骨的功能及力学特性还有待进一步的研究。
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