绿色荧光标记C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测

                作者：陈腾祥，夏高晓，陈丽，刘亚伟，刘靖华，姜勇 

【摘要】  　　目的： 表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白，通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法: 用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析，获得复性的His-EGFP-CRP蛋白；并用高效毛细管电泳（HPCE）技术对复性的蛋白进行检测，了解蛋白质的等电点及活性。结果: 转化实验发现，该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21（DE3）中能够被诱导表达；通过包涵体变性溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白；HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个，其在电泳液pH值低于6时易检出，His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多。结论: 成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP，通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白，复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6，以单体或多聚体等结构形式存在，具有结合活性，能与细胞内相关分子结合成复合物，可应用于CRP功能和内化机制的研究。

【关键词】  C反应蛋白； 基因表达； 蛋白质复性； 电泳，毛细管

　　［Abstract］ Objective: To express the purified recombinant protein, His-EGFP-CRP, and to evaluate the feasibility of its application in the research of function and internalization mechanism of human C-reactive protein （CRP）. Methods: The re-constructed vector pET14b/EGFP-hCRP was transformed into Escherichia.coli BL21（DE3）, induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）. The expressed protein, His-EGFP-CRP, was purified with affinity chromatography method and refolded with gradient filtration. The renatured His-EGFP-CRP was analyzed with high performance capillary electrophoresis （HPCE） to evaluate its isoelectric point （pI） and bio-activity. Results: Fusion protein His-EGFP-CRP successfully expressed in transformed E. coli cells after the induction, and then was purified with inclusion lysis and affinity chromatography. His-EGFP-CRP was detected at several peaks of the fraction profile of HPCE when the pH of electrophoresis buffer was under 6. The number of His-EGFP-CRP detection peaks increased after the protein was incubated with lysate of THP-1 cells. Conclusions: The pI of His-EGFP-CRP is about 6, and its structures may be monomer or polymer, which have the ability to bind relative molecles in lysate of THP-1 to form complex. These results suggest the recombinant protein could be used in exploiting the function and internalization mechanism of human CRP.

　　［Key words］ C-reactive protein; gene expression; protein renaturation; electrophoresis,capillary

    C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）是一种发现较早的蛋白质，在急性心肌梗塞、创伤、感染、炎症、外科手术和肿瘤侵润时，其血浆浓度急剧升高，达到正常水平的数百倍，乃至数千倍，可以作为上述疾病的临床监测指标，是急性期蛋白的主要成员之一［1］。CRP在免疫反应过程中能识别病原体和宿主受损细胞，介导补体系统和吞噬细胞将它们清除，发挥免疫调理功能［2］。除此之外，近些年来研究表明CRP的功能十分复杂，发现其能通过胞膜进入培养的主动脉内皮细胞，从而参与粥样动脉硬化症等心血管疾病的发生［3～5］。然而，对于CRP内化进入细胞的行为和机制还缺乏深入的研究，原因之一是纯化原核表达的CRP有较大难度，不易获得有体外活性的重组表达物。为解决这一技术难题，构建了带his纯化标签和EGFP荧光标记的人CRP原核表达质粒［4］。在此工作基础上，对该融合蛋白的表达纯化和复性进行了探索，并利用高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）技术对复性后的重组蛋白进行检测分析，以进一步了解该重组蛋白的基本理化特点，检测该蛋白的活性。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　台式低温高速离心机、台式冷冻离心机和PA800毛细管电泳仪（Beckman Coulter公司）；Mini VE垂直电泳系统（GE Healthcare公司）；原核表达质粒pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP（分别由广东省蛋白质组学重点实验室郭爱华和陈腾祥构建）；大肠杆菌菌株DH5α（本室保存）；质粒纯化试剂盒（U-Gene公司）；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）由Calbiochem公司生产；microcon YM-10超滤浓缩装置（Millipore公司）；TALON Metal Affinity Resin（BD Bioscience Clontech公司）；透析袋（Merck公司）；人单核细胞系THP-1（香港大学医学院徐爱民教授惠赠）；无内毒素的RPMI-1640培养液和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）由Hyclone公司生产；protease inhibitor cocktail（sigma公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  质粒pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表达 

　　用pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP分别转化BL21（DE3）大肠杆菌菌株，各挑取3个克隆到5 ml LB培养液（Amp+）中，37 ℃振荡扩增，当菌液OD值约为0.4时，加入5 μl 100 mmol/L IPTG到5 ml的菌液中，室温振荡4 h，取1 ml菌液3 000 r/min离心5 min，加入200 μl 1倍SDS上样缓冲液重悬沉淀，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。各取表达目的蛋白的克隆1 ml加入到200 ml LB培养液（Amp+）中，按上述表达条件进行大量诱导表达。

　　1.2.2  His-EGFP蛋白的纯化 

　　按TALON Metal Affinity Resin试剂盒说明书，配制结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 ℃ 8 000 r/min离心菌液10 min，用4 ml 冰冷的结合缓冲液重悬细菌沉淀，超声波裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清加入到装有TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，按操作说明进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。

　　1.2.3  His-EGFP-CRP蛋白的纯化

　　配制缓冲液A（50 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、5％甘油、0.5 mmol/L DTT，pH 7.9）。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP-CRP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 ℃ 8 000 r/min离心菌液10 min，用10 ml含 5％TritonX-100缓冲液A重悬沉淀，超声波裂解细菌，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min。沉淀（主要为包涵体和细菌碎片）转入5 ml的玻璃匀浆器内，加入10 ml含5％TritonX-100的缓冲液A充分匀浆沉淀，室温静置20 min，匀浆液离心后取沉淀重复匀浆洗涤1次。加入10 ml含3％十二烷基肌氨酸钠（SKL）和0.3％十二烷基硫酸钠（SDS）的buffer A，充分重悬沉淀，静置60 min以缓慢溶解包涵体。溶解产物4℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清加入到microcon YM-10中，超滤浓缩到原体积的1/2。然后加入到TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。

　　1.2.4  SDS-PAGE检测质粒原核表达和蛋白纯化情况 

　　分别取少量未转化质粒的BL21（DE3）、诱导表达的转化子、转化子菌液裂解后的离心沉淀物及上清、亲和纯化的洗脱液，加入SDS上样缓冲液，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达和纯化情况。

　　1.2.5  蛋白质重折叠复性及缓冲液置换 

　　上述亲和纯化得到的His-EGFP和His-EGFP-CRP蛋白液分别加入到截留分子量为10 kD透析袋中，放入到500 ml含0.5 mmol/L DTT的Buffer A中，4 ℃透析12 h，每3 h更换透析液；将透析袋放入另一个500 ml的透析体系（含1 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG和0.6 mmol/L L-精氨酸的PBS）中，4 ℃透析12 h，每3 h更换透析液；最后放入500 ml PBS溶液中，4 ℃透析3 h，重复4次。用0.22 μm的滤膜过滤除菌，Bradford方法定量，分装后贮存于-80 ℃。

　　1.2.6  荧光蛋白的高效毛细管电泳检测 

　　分别取纯化后的His-EGFP和His-EGFP-CRP的蛋白样品，用PBS将浓度稀释为100 mmol/L，按操作说明加入到毛细管电泳仪PA800的专用样品管内以备进样检测；检测器选用激光诱导荧光（laser induced fluorescence, LIF）模组，检测波长为488 nm；毛细管柱为N-CHO内涂层的石英毛细管，内径50 μm，总长度为50.2 cm，从进样端至检测窗口的长度为40 cm；采用真空抽吸进样，压力为2 psi，进样时间10 s，电泳电压为20 kV，进样端设置为正极，检测端为负极。分别使用pH值为7.0、6.0、5.0、4.0、3.0的电泳缓冲液（0.1% Tween 20，100 mmol/L 四硼酸纳）对上述2种样品进行分离检测。

　　1.2.7  细胞培养及His-EGFP-CRP结合活性检测 

　　THP-1用含10% FBS的RPMI-1640在CO2培养箱（37℃，5％CO2）中培养。细胞培养至1×1010个/L时，取5 ml细胞培养物于25 ℃ 1 000 r/min离心5 min，弃上清，用细胞裂解液（10%甘油、50 mmol/L Hepes-KOH、100 mmol/L KCl、0.1% NP-40、2 mmol/L DTT、10 mmol/L NaF、0.25 mmol/L NaOVO3、50 mmol/L β-甘油磷酸）1 ml、10 μl protease inhibitor cocktail重悬沉淀，4 ℃静置1 h后，4 ℃ 14 000 r/min离心20 min。离心上清中分别加入His-EGFP和His-EGFP-CRP的蛋白样品（终浓度为100 mmol/L），混匀后于37 ℃静置30 min，加入的样品管中，按上述参数进行高效毛细管电泳检测。

　　2  结果

　　2.1  pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表达及其蛋白纯化　　
　　如图1A所示，与未转化质粒的BL21（DE3）相比较，转化了pET14b/MCS-EGFP的感受态细菌经IPTG于室温诱导后，在约30 kD分子量处出现了一条特异性条带，与His-EGFP的理论分子量（约29 kD）接近，表明诱导表达成功；菌液经超声裂解后，离心得到的沉淀和上清中均检测到高丰度的His-EGFP蛋白，说明His-EGFP的可溶性很好，但由于表达量很高，部分蛋白也可能在形成的包涵体内。经过金属Ni离子亲和色谱法纯化后，结果显示获得的目的蛋白纯度和回收率均很高。　　

　　如图1B所示，pET14b/EGFP-hCRP转染感受态BL21（DE3）并诱导后，在约50 kD处出现1条表达量不是很高的特异性条带，与His-EGFP-CRP的理论分子量值接近，说明诱导表达成功；菌液经超声裂解后，沉淀中可检测到大量的His-EGFP-CRP蛋白，而上清中几乎检测不到相应的条带，提示原核中表达的His-EGFP-CRP溶解性很差，基本以包涵体的形式存在。包涵体经过洗涤、溶解后释放出His-EGFP-CRP，经亲和色谱法纯化，得到纯度较高的目的蛋白，回收率低于His-EGFP的纯化。

　　2.2  His-EGFP和His-EGFP-CRP样品HPCE检测　　

　　如图2A和2B，当电泳缓冲液pH为7和6时，His-EGFP和His-EGFP-CRP的分离检测效果很差，几乎没有荧光信号被检测到；当pH值小于或等于5时，可以检测到波长为488 nm的绿色荧光信号，随电泳缓冲液pH逐渐减小，信号峰的峰宽也逐渐减小，峰高增加。His-EGFP的检测为单峰，提示His-EGFP的结构形式较为单一；而对于His-EGFP-CRP，pH值为5时，可检测到2个峰，分辨率较低；pH值为4和3时，可检测到3个峰，说明该蛋白的结构形式有多样性。

　　2.3  His-EGFP-CRP结合活性检测    

　　对加入了His-EGFP的细胞裂解物进行HPCE，除了在5～9 min处有一些微小峰外，其分离图谱与单纯的His-EGFP样品检测没有明显差异（见图2A和图2C）。相对于单纯His-EGFP-CRP样品检测，加入了His-EGFP-CRP的THP-1裂解物的分离图谱出现了明显的改变，3～7 min处峰群的峰高和峰面积明显减少，在8～13 min处出现了新的峰群，以电泳液pH为4时最为明显（见图2B和2D）， 提示His-EGFP-CRP与某些细胞分子结合成为复合物，从而使其延迟时间发生了改变。

　　3  讨论

　　通过基因重组进行质粒构建、原核诱导表达、蛋白纯化和复性的探索，拟为深入研究CRP内化入胞机制和胞内功能提供研究工具。在表达纯化的探索中，发现原核表达的人CRP重组蛋白的溶解性很低，基本上以包涵体形式存在，利用高浓度的尿素和盐酸胍等变性剂溶解包涵体的效果不佳，通过多次摸索，利用SKL、TritonX-100、SDS等去污剂和二硫键还原剂DTT增加了溶解包涵体和重组蛋白的能力，用金属离子亲和色谱方法获得较纯目的蛋白，在氧化还原体系GSH/GSSG和L-精氨酸条件下，通过缓慢降低去污剂的梯度透析方法对纯化的蛋白质进行复性处理。　　

　　蛋白质复性后，利用HPCE技术对重组蛋白的一般理化性质和结合活性进行检测。分离模式采用区带毛细管电泳（capillary zone electrophoresis, CZE），同时电泳液中加入少量（低于胶束浓度）的非离子型去污剂（Tween 20）以减少蛋白质在管壁上的粘附。在这种分离模式下，带正电荷的蛋白质由正极向负极迁移，并在负极端用LIF模组检测，带绿色荧光的蛋白质通过时可被检测。结果发现，当电泳液pH≤5时，方可检测到His-EGFP-CRP的荧光信号，因此提示融合蛋白His-EGFP-CRP的等电点（pI）接近于6，该蛋白质在低于其pI的溶液中带正电荷，易于在该电泳模式下分离检测。His-EGFP的检测结果与His-EGFP-CRP相近，表明2种重组蛋白pI接近。　　

　　与His-EGFP的单峰相比较，His-EGFP-CRP的检测出现多个峰，可能原因是复性后His-EGFP-CRP以多种结构形式存在。CRP阅读框由2个外显子和1个内含子组成，编码含187个氨基酸的单体蛋白［1］。在血浆、组织液和细胞内，CRP的结构形式具有多样性：有分子量为21 kD的单体形式，也有由5个相同的单体（亚基）以非共价交联的方式聚合成五角型盘状结构，还有研究发现单体可以聚合成为纤维状的结构［6］。这些结构的多样性在一定程度上可以解释CRP功能的多样性。本工作构建的融合蛋白是在CRP的3’端挂上EGFP和his标签，要使其能应用于CRP功能和内化机制的研究，其前提条件之一是增加的EGFP和his氨基酸序列不能影响CRP的结合活性。HPCE的结果显示复性后的His-EGFP-CRP可能存在单体和多聚体的结构形式，提示CRP的聚合特性没有受到His-EGFP影响。至于His-EGFP-CRP的多聚体结构形式，还需深入研究。　　

　　已有研究表明CRP能够与小核核糖体蛋白、组蛋白、层粘连蛋白、磷酸胆碱和磷酸乙醇胺等细胞内或细胞膜上的分子物质结合［1，7］。为了解His-EGFP-CRP是否具有CRP的结合活性，将His-EGFP-CRP与单核细胞THP-1的裂解物进行孵育结合，HPCE结果发现His-EGFP-CRP的检测峰增多了，提示His-EGFP-CRP与细胞裂解物中的一些分子结合形成了复合物；而单独的His-EGFP仍然为单峰，并没有形成复合物，说明His-EGFP-CRP结合活性是由其中的CRP部分所产生的，His-EGFP不影响其结合活性。本研究表明表达纯化及复性的CRP融合蛋白虽然在3’端增加了His-EGFP序列，但是仍然保留CRP的结合活性，可以用于CRP胞内功能和内化机制的研究。　　

　　致谢：感谢广州启动子生物科技公司在实验中给予的技术支持和帮助。

【】
  　　［1］Volanakis JE. Human C-reactive protein: expression, structure, and function［J］. Mol Immunol，2001 （2-3）:189-197.

　　［2］Black S, Kushner I, Samols D. C-reactive Protein［J］. J Biol Chem，2004 （47）:48487-48490.

　　［3］Devaraj S, Clos T W D, Jialal I. Binding and internalization of C-reactive protein by Fcgamma receptors on human aortic endothelial cells mediates biological effects［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005 （7）: 1359-1363.

　　［4］陈腾祥，李红梅，胡水旺，等. 重组人CRP的表达纯化及其内化进入Hela细胞的观察［J］.病理生杂志，2008 （6）:1155-1160.

　　［5］Hirschfield GM, Pepys MB. C-reactive protein and cardiovascular disease: new insights from an old molecule［J］. Q J Med, 2003 （11）: 793-807.

　　［6］Wang HW, Wu Y, Chen Y, et al. Polymorphism of structural forms of C-reactive protein［J］. Int J Mol Med，2002 （6）:665-671.

　　［7］Pepys MB, Booth SE, Tennent GA, et al. Binding of pentraxins to different nuclear structures: C-reactive protein binds to small nuclear ribonucleoprotein particles, serum amyloid P component binds to chromatin and nucleoli［J］. Clin Exp Immunol, 1994 （1）:152-157.