黄芩苷抗呼吸道合胞病毒感染作用的体外研究

                        作者：张丽亚 董琳 陈小芳 王平

【摘要】  目的 探讨黄芩苷（baicalin）的体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染作用及最佳浓度。方法 应用微量细胞培养技术，观察RSV感染人喉癌（Hep-2）细胞病变效应（CPE）。观察不同浓度黄芩苷对人肺癌腺上皮（A549）细胞的CPE及RSV感染后CPE的抑制作用。应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测黄芩苷对A549细胞的毒性作用和RSV感染后细胞存活率的影响。结果 黄芩苷浓度≤0.156mg/ml时，A549细胞未显示明显CPE，MTT比色法结果与CPE观察结果相符；浓度在0.078～1.25mg/ml时，RSV感染的A549细胞仅出现轻微CPE，0.625mg/ml时对CPE有最好的保护作用；指数（TI）为19.23；MTT比色法也显示以上浓度范围黄芩苷组的细胞存活率明显高于RSV感染组，差异有统计学意义(P均<0.05)，其中以0.3125 mg/ml组的细胞存活率最高，达82.09%。结论 黄芩苷具有体外抗RSV感染作用，有效浓度为0.078～1.25mg/ml，最佳作用浓度为0.156mg/ml。

【关键词】  黄芩苷 呼吸道合胞病毒 抗感染 体外实验

【Abstract】  Objectives  To search the effect of baicalin for infection of respiratory syncytial virus（RSV）and the best effective concentration. Methods  Micro-well cell cultures was adopted，and cytopathogenic effect (CPE) of HEp-2 cells induced by RSV infection were observed through inverted phase-contrast microscopically. The CPE of A549 cells induced by baicalin of different concentration and the effects of baicalin on change of CPE of A549 cells induced by RSV infection were observed through inverted phase-contrast microscopically, too. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was used to detect cytotoxicity of baicalin on normal A549 cells and protective effects of it on RSV infected A549 cells. Results  When the concentration of baicalin was equal or less than 0.156mg/ml, there were no significant CPE in the baicalin group and it has the same result when MTT assay was used;When the concentration extent of baicalin on RSV infected A549 cells were 0.078-1.25mg/ml , there were less CPE and higher survival rate than RSV infected but no baicalin interfered group,and it has the best protection effect at concetration of 0.625mg/ml; the treatment index（TI）of baicalin was 19.23; there has significiant differences between the two groups when MTT assay was used (P<0.05)，and it has the max survival rate to 82.09% when the concentration was 0.3125 mg/ml.  Conclusions  Baicalin can counteract the infection of RSV in A549 cells ,the effective concentration extent is 0.078mg/ml-1.25mg/ml ,and the best anti-infection concentration is 0.156mg/ml .

    【Key Words】  Baicalin  Respiratory cyncytial virus (RSV )   Anti-infection  Empirical study in vitro　

　    呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的最主要病原,可导致严重的毛细支气管炎和肺炎,危害婴幼儿健康［１］。针对RSV F蛋白的单克隆抗体palivizumab可用于高危人群流行季节的预防和治疗［２］,但有研究发现RSV感染的细胞和棉鼠模型中会出现palivizumab的抵抗株［3，4］,且其价格昂贵,从而限制其使用。中药黄芩为黄酮类化合物，有效成分包括黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩素、汉黄芩苷等，是常用的清热燥湿、泻火解毒中药，具有抗氧化、抗变态反应、抑制病毒、细菌及抑制肿瘤等广泛的药理活性。体外研究初步显示黄芩提取物有抑制RSV复制的作用［５，６］,作者自2008年3至6月研究黄芩苷单体的体外抗RSV作用及最佳作用浓度，报道如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料  (1)实验用药：中药黄芩苷粉针剂,为黄色晶体, 购自南京泽朗医药科技有限公司（批号ZL-A-018），纯度98.12%。取5mg黄芩苷溶于PBS缓冲液中,调pH至7.4,使其完全溶解,成为5mg/ml母液, 实验时用维持液稀释成相应浓度。(2)细胞：喉癌的上皮细胞株(Hep-2) 和人肺腺癌的气道上皮细胞株(A549) 购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。(3)病毒：RSV分离株, 购自预防医学院病毒所。(4)主要试剂：四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Amresco，FBS为四季青公司产品，RPMI-1640培养液和0.25%胰酶均为GIBCO公司产品。细胞生长液为10% FBS的RPMI-1640培养液, 内含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素, 细胞维持液除FBS含量为2%外,其它成分同细胞生长液。

    1.2  方法   (1)人肺癌腺上皮(A549)和Hep-2细胞培养：细胞以1×105/ml浓度接种于25cm2培养瓶中,置于37℃, 5% CO2培养箱培养,每隔2d换液,待细胞长至80%融合状态时用于实验。(2)RSV增殖：将冻存的病毒株复苏后接种于对数生长期Hep-2细胞上,于2～5 d出现细胞病变,待病变达100%时收获病毒, 置-20℃≥2h，37℃反复冻融3次。3000转/min 离心10min，弃沉淀，收集病毒上清，即为备用的病毒原液，分装后于-80℃保存。(3)RSV半数感染量（TCID50）的测定:Hep-2细胞以1×105/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl。病毒原液用维持液10倍系列稀释9个浓度。细胞长成单层时吸弃培养液，D-Hanks液洗2次，接种各稀释度的病毒液，每个浓度6个复孔，每孔50μl。并设正常细胞对照组。置33℃、CO2培养箱中吸附2h后吸弃上清液，每孔加维持液100μl，置培养箱中继续培养。逐日观察细胞病变效应(CPE)并记录，连续观察7d，用Reed-Muench公式［７］病毒TCID50。本实验采用病毒滴度为TCID50:10-7.7/50μl。(4)黄芩苷对细胞的毒性测定(即药物的无毒限量测定)：将成层良好的A549细胞经消化成单个细胞,用生长液调整细胞数至1×105/ml, 按0.1 ml/孔加入96孔微量细胞培养板中, 48 h后形成单层细胞备用。用D-Hanks液清洗2次后加入维持液递倍稀释（1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256）后的黄芩苷，每个浓度6个复孔，每孔100μl，并设正常细胞对照。置37℃、5%CO2培养箱中培养，观察细胞融合、坏死、脱落、漂浮、死亡等CPE，表示为［８］: 0％～25% ( + ) , 25%～50% (++ ) , 50%～75%( +++) , 75%～100% (++++)，采用Reed-Muench法［９］计算CPE不再进展时(约72 h)黄芩苷对A549细胞的半数中毒浓度（TD50）。然后每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml) ,继续培养4h, 倒置显微镜下观察MTT结晶状况,然后弃去孔内上清液,每孔内加入150μl二甲基亚砜, 低速振荡10min后, 在酶联仪A490nm下测定光密度(OD) 值,并设630nm为参照波长，取6孔平均值确定药物的最大无毒浓度。此实验重复3次。(5)黄芩苷的抗RSV作用测定：待A549细胞80%融合良好后,加入100TCID50的病毒50μl感染细胞, 33℃、5% CO2 孵箱中吸附2h,轻轻晃动培养板1次/30min,以使病毒吸附均匀。吸附结束后吸弃上清液, D-Hanks液洗2次,黄芩苷组加入用维持液递倍稀释成不同终浓度的黄芩苷100μl, 同时设正常细胞对照组、RSV感染未处理组。每组6个复孔，置于37 ℃、 5% CO2 孵箱中培养,逐日在倒置显微镜下观察CPE , 待病毒感染未处理组CPE达到+++～++++终止实验并摄像，按Reed-Muench 法计算黄芩苷对RSV致CPE产生50 %抑制的浓度,即药物的半数有效量(IC50)，并按药物的治疗指数（TI）公式：TI=TD50/IC50计算黄芩苷的治疗指数。而后用MTT比色法计算细胞存活率, 公式为:细胞存活率% =实验组吸光度值(A)/对照组吸光度值(A)×100%。此实验重复3次。

    1.3  统计学处理  结果以(x±s)表示,采用SPSS 13.0软件进行方差分析和LSD-t检验, P<0.05为有显著性差异。

    2  结果

    2.1  黄芩苷的细胞毒性实验    　　当黄芩苷浓度≤0.156 mg/ml时，A549细胞形态规则, 排列紧密有序,未出现明显CPE,根据CPE结果TD50为0.9375 mg/ml。MTT比色法结果与CPE观察结果相符，与正常细胞对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）（见表1）。表明黄芩苷浓度≤0.156mg/ml为安全浓度范围。表1  黄芩苷对A549细胞无毒限量的测定

   2.2  黄芩苷的抗RSV作用  　　将感染RSV的A549细胞用黄芩苷处理后,显微镜下逐日观察CPE, 当RSV感染组CPE达+++ ～ ++++时,黄芩苷浓度在0.078～1.25mg/ml范围内仅出现轻微CPE，0.625mg/ml时对CPE有最好的保护作用，基本未见CPE，计算IC50=0.049mg/ml，故TI=19.23。进一步通过MTT比色实验检测不同浓度黄芩苷抗RSV效应, 结果显示黄芩苷浓度在0.078～1.25mg/ml范围内，细胞存活率明显高于RSV感染组，差异有统计学意义(P< 0. 05)，其中以0.3125 mg/ml组细胞存活率最高，达82.09%（表2）。综合MTT比色法与CPE结果，可见浓度在0.3125～0.625mg/ml作用时对A549细胞有最大的保护作用，随着浓度的升高或降低，保护作用也随之下降，可能因随浓度升高药物的细胞毒性也随之升高，随浓度降低则抗RSV感染作用也随之降低。  表2  黄芩苷抗RSV效应

　　　3  讨论

    中药单体与复方制剂相比既可增加疗效，又可减少副作用，因而研究中药单体的药效学研究意义更大，更有利于临床推广及应用。在进行药物体外抗病毒的研究中, 最为常用的方法是观察细胞病变效应(CPE), 但此法有一定的主观性, 且不能进行精确的定量分析, 可能因为在进行观测时, 部分细胞的形态学虽属正常, 但由于其线粒体遭到破坏, 细胞中琥珀酸脱氢酶可能遭受更严重的破坏, 此时的细胞形态学不能真实地反映CPE程度。而MTT比色法简单直观,与CPE法相结合可定量地评估药物抗病毒的活性,因此可广泛用于对抗病毒药物的初步筛选［１０］。本实验结合两种方法，提高了实验的准确度，结果证实黄芩苷既能抑制RSV感染的CPE，又可提高细胞存活率，具有体外抑制RSV作用，且毒性小，安全范围大。结合无毒限量测定结果及抗病毒作用结果分析，其有效浓度范围为0.078～1.25mg/ml，0.156mg/ml为其抗RSV感染的最佳浓度。而且采用指数(TI)作为评价指标来衡量药物对病毒抑制的效力。指数大于1为有效,指数越大,安全范围越大。本实验得出黄芩苷的TI=19.23，充分说明此药物抗RSV的有效性。至于黄芩苷在抗RSV作用外是否还具有抗炎作用及其机制，是今后进一步研究的方向。

【】
  1 侯伟. 细胞因子与呼吸道合胞病毒感染. 国外医学儿分册, 1996, 23 (5) : 251～254.

2 Grimaldi M, Gouyon B, Sagot P. Palivizumab efficacy in preterm Infants with gestational age < or = 30 weeks without bronchopul-monary dysplasia. Pediatr Pulmonol，2007, 42 (3) : 189～192.

3 Zhao X, Chen FP, Sullender WM. Respiratory syncytial virus escape mutant derived in vitro resists palivizumab prophylaxis in cotton rats. Virology, 2004, 318 (2) : 608～612.

4 Krilov LR. Safety issues related to the administration of Ribavirin.Pediatr Infect D is J, 2002, 21 (5) : 479～481.

5 Ma SC, Du J, But PP, et al. Antiviral Chinese medicinal herbs against respiratory syncytial virus. J Ethnopharmacol, 2002, 79:205～211.

6 杨 洁，刘 萍.黄芩提取物及含药血清体外抑制呼吸道合胞病毒作用的实验研究.科学技术与工程，2007,7(12):2784～2786.

7 傅继华.病毒学实用实验技术.山东：科学技术出版社,2001. 60～64.

8 赵长安,赵晓东,俞海国，等. 脱氧核酶在培养细胞内抗呼吸道合胞病毒效应的研究. 中华儿科杂志, 2003, 41 (8) : 594～597.

9 司徒镇强,吴军正. 细胞培养. 西安:世界图书出版西安公司,2004.200.

10 刘媛媛,杨占秋，何静，等.MTT分析法、空斑减数法及CPE观察法评估药物体外抗病毒效果的比较与分析.武汉大学学报，2005，26 (2) :199～202.