肿节风药材中反丁烯二酸提取工艺的研究
作者：陈磊 李远 赵中流 田薇
【摘要】 目的以肿节风药材为原料，并用RP-HPLC(反相高效液相色谱)外标法进行含量测定。方法在单因素试验的基础上，选取提取溶剂、提取方法和提取液pH值这3个因素进行了3因素2水平的正交试验，进而筛选出最优的水平组合。结果提取肿节风药材中反丁烯二酸的最佳提取工艺是：提取液pH值为4.0；提取方法为微波提取5.0 min；提取溶剂为70％乙醇溶液。结论实验结果为确定肿节风药材中反丁烯二酸提取工艺提供了实验依据。
【关键词】 肿节风 提取工艺 反丁烯二酸 正交实验
Abstract：ObjectiveTo determine the content of the fumaric acid which was extracted from Herba Sarcandrae by RP?HPLC.MethodsOn the basis of the single factor experiment, three factors were chosen with orthogonal design: extraction solvent,extraction method, PH value, then the optimal combinations of levels was defined. ResultsThe results showed that the optimal combinations of levels of extracted fumaric acid from Herba Sarcandrae were extracted with 70% ethanol and microwave irradiation for 5 minutes, and the pH value was 4.0. ConclusionThe result provides a technology for the extraction of fumaric acid from Herba Sarcandrae.
Key words：Herba sarcandrae; Extraction; Fumaric acid; Orthogonal test
肿节风Herba Sarcandrae (英)为2005版《药典》第Ⅰ部收载品种，为金粟兰科Chloranthaceae植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunberg) Nakai的干燥全株［1］。药理和毒理研究表明肿节风具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗肿瘤、促进骨折愈合及镇痛等多种活性［2～4］。其中，有机酸类成分反丁烯二酸具有抗菌消炎的药理活性［5］。目前，在质量控制上针对肿节风药材的含量测定指标共有3个。即异秦皮啶、反丁烯二酸和总黄酮［5］。这些化学成分(或有效部位) 已经药理实验证明具有一定的抗菌、消炎、止痛或抗肿瘤活性。资料表明，《中国药典》和部颁标准中肿节风药材及其制剂的质量控制指标多为单一成分。此外，已有的研究资料表明,对肿节风及其制剂化学成分的定性定量分析虽有较多报道，但单独针对肿节风药材中的反丁烯二酸提取工艺进行研究的尚未见报道。因此，通过不同工艺方法来提取肿节风药材中的反丁烯二酸，并应用HPLC法测定其含量，然后分析不同方法对含量测定结果的影响，进而确定最佳提取工艺，可以为肿节风药材质量控制提供依据。
1 器材
肿节风药材，市售（浙江省临安市益寿堂药店），产于长江以南各省；95%乙醇，丙酮均为分析纯（衢州巨化试剂有限公司），甲醇为一级色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司），乙腈为特级色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；对照品为反丁烯二酸（≥99％），含量测定专用；Waters515高效液相色谱仪，包括2695四元数码泵，2420蒸发光闪射（紫外）检测器，EMPOWER2 色谱管理系统等；精密分析天平（FA2104N）；无级可调台式超声清洗器（SK8200HP）；微波提取设备（NJ107-3）等。
2 方法
2.1 样品中反丁烯二酸的含量测定
2.1.1 色谱条件［6］
色谱柱为C18对称柱（4.6 mm×250 mm)；流动相为0.08％磷酸?乙腈（9:1,V/V）；流速0.6 ml/min；柱温为室温；检测波长220 nm。
2.1.2 样品溶液的制备准确称取0.15g肿节风药材粉末加75%乙醇30 ml，置50 ml锥形瓶中 →（加浓HCl, 调节pH值） → 冷浸8～9 h → 提取 → 抽滤 → 恒温水浴中，浓缩蒸干 → 加甲醇（色谱纯）溶解，转移至10 ml容量瓶，定容 → 0.45 μm微孔滤膜过滤 → 即得样品溶液
2.2实验方案
2.2.1 单因素实验
提取溶剂对样品溶液中富马酸含量的影响:按照“2.1.2”项样品溶液制备的工艺流程，改变提取溶剂进行实验，不调pH值，并采用超声提取法，提取时间为1.5 h；提取溶剂分别为：水、丙酮、70％乙醇；制备样品溶液，并样品溶液中的反丁烯二酸含量。
提取方法对样品溶液中富马酸含量的影响：按照“2.1.2”项样品溶液制备的工艺流程，改变提取方法，提取溶剂为70％乙醇，不调pH值；提取方法分别为：超声提取1.5 h，索氏提取4 h（提取前不冷浸）；制备样品溶液，并计算样品溶液中的反丁烯二酸含量。
2.2.2 正交实验设计［7］
根据资料和单因素实验的结果，选取了以下3个因素：提取溶剂、提取方法、提取液pH值，并按照正交实验表L4(23)进行正交实验。
3 结果
3.1样品
中反丁烯二酸的含量测定结果反丁烯二酸标准品的HPLC检测结果见图1。
3.2 方法
学考察线性关系实验：精密称取反丁烯二酸0.06 g加甲醇定容至25 ml容量瓶，摇匀，用移液管从中移取1 ml，加甲醇定容至100 ml容量瓶，摇匀，再用移液管分别移取该溶液1，5，10，15，20 ml，并分别加甲醇，定容至25 ml容量瓶，摇匀，即得不同浓度的对照品。
分别吸取不同浓度的对照品进样10 μl，计算回归方程。结果显示：回归方程为Y＝1.964×105X，r=0.998 1。表明反丁烯二酸对照品溶液在0～23.424μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。反丁烯二酸标准曲线见图2。
精密度实验：精密移取对照品10 μl，重复进样5次，测定每次进样后反丁烯二酸峰面积的值。测定每次进样后反丁烯二酸峰面积的值分别为2 793 074，2 787 123，2 787 156，2 806 023，2 806 991，其RSD为0.35％，结果表明仪器精密。
回收率实验：精密称取反丁烯二酸0.010 9 g，即备用的对照品溶液A浓度为109 μg/ml。精密称取药材粉末0.15 g 5份分别置50ml容量瓶中，再精密吸取对照品溶液A各1 ml，分别置上述容量瓶中，按“2.1.2“样品溶液制备的工艺流程，制备样品溶液。回收率计算公式如下：回收率(%)＝(C-A)/B×100其中A为已知被测物含量的样品，B为加入的被测物量，C为测出的含量。结果见表1。表1 反丁烯二酸回收率测定结果（略）
稳定性实验：精密称取药材粉末0.15 g 5份分别置50 ml容量瓶中,按“2.1.2”项样品溶液制备的工艺流程制备样品溶液。取平行样5份。结果见表2。表2 最优提取工艺提取的样品溶液测定结果（略）
3.3 单因素实验结果
3.3.1 提取溶剂的选择
提取溶剂与样品溶液中富马酸百分含量的关系（见图3）。结果显示，采用70％的乙醇作为提取溶剂的样品溶液中富马酸百分含量最高，其次为水，最低的为丙酮；表明提取样品中的富马酸，在同等条件下，70％的乙醇提取效果最好。
3.3.2 提取方法的选择提取方法与样品溶液中富马酸百分含量的关系，如图4所示。结果显示：采用超声提作为提取方法的样品溶液中富马酸百分含量最高，其次为索氏提取；表明提取样品中富马酸，在同等条件下，超声提取1.5 h的效果较好。
