左金丸方药3种方法提取液的初步药效学比较

【摘要】  目的观察左金丸方药的3种提取液的抑菌、抗炎作用。方法分别制备左金丸的水提取液（WE液）、60%乙醇提取液（AE液）和半仿生提取液（SBE液），采用抑菌环实验和二甲苯致小鼠耳肿胀法分别评价左金丸的AE液、SBE液、WE液的抑菌、抗炎的药效作用。结果左金丸提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌，抑菌环的大小顺序为：SBE液> WE液> AE液。左金丸提取液对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著抑制作用，肿胀抑制率大小顺序为：SBE液> WE液> AE液。结论左金丸方药的3种提取液的抑菌、抗炎作用大小顺序为：SBE液> WE液> AE液。

【关键词】  左金丸； 药效学； 抗菌； 抗炎； 水提取液； 乙醇提取液； 半仿生提取液

左金丸是由黄连与吴茱萸按6∶1比例制成的水丸，具泻火、疏肝、和胃、止痛功能，为辛开苦降的代表方剂，临床上常用于胃炎、胃脘痛、消化性溃疡等疾病。现代药理研究表明，左金丸具有抗溃疡、抑菌、抗炎等作用。

    目前对左金丸方药的水提取液、60%乙醇提取液和半仿生提取液的抑菌、抗炎的药效作用的研究未见报道。本研究以左金丸方药的水提取液（WE液）、60%乙醇提取液（AE液）和半仿生提取液（SBE液），采用抑菌环实验和二甲苯致小鼠耳肿胀法分别评价左金丸的AE液、SBE液、WE液的抑菌、抗炎的药效作用。

    1  抗（抑）菌实验（抑菌环实验）

    利用抑菌剂不断溶解琼脂，扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。实验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本实验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。

    1.1   器材金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099) 菌悬液，抑菌剂载体 (5 mm 直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸气灭菌处理后，置120℃烤干2 h，保存备用)，微量移液器(5～50 μl，可调式)，游标卡尺，营养琼脂培养基。

    1.2   供试液的制备提取前将黄连、吴茱萸药材分别粉碎，过14目筛。

    1.2.1  水提取液按照处方比例分别称取黄连粗粉12 g， 吴茱萸粗粉2 g，用水加热回流提取 3 次，时间分别为2，2，1 h，加水量依次为药材量的10，8，8倍，4层纱布加100目筛滤过，合并提取液，减压浓缩至60 ml样品液（每毫升相当于原药材0.23 g）。

    1.2.2    60%乙醇提取液按照处方比例分别称取黄连粗粉12 g，吴茱萸粗粉2g,用60％乙醇浓度加热回流提取工艺提取，回流3次，时间分别为2，2，1 h，加醇量依次为药材量的10，8，8倍，4层纱布加100目筛滤过，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩至60 ml样品液（每毫升相当于原药材0.23 g）。

    1.2.3   半仿生提取液按照处方比例分别称取黄连粗粉12 g,吴茱萸粗粉2 g, 混匀，加热回流提取3次（加水量依次为药材量的10，8，8倍，用水煎煮3次，第 1 煎用水以0.1 mol/L HCl调至pH2.0；第2、3煎用水依次以0.1 mol/L NaOH 调至pH 7.0，9.0；煎煮时间依次为170 min,85 min,40 min），提取液用 4 层纱布加100目筛分别滤过，离心（2 000 r/min,20 min）,合并上清液，减压浓缩至60 ml样品液（每毫升相当于原药材0.23 g）。

    1.3  操作程序

    1.3.1  抑菌片的制备取无菌并干燥的滤纸片，制成直径为 5 mm，厚不超过 4 mm 圆片(块)，每 4 片(块) 1 组，每片滴加1.2项下 3 种供试液各20 μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃) 中烤干后备用。

    1.3.2   阴性对照样片的制备取无菌干燥滤纸片，制成与试验组大小相同的样(块)。每片滴加无菌蒸馏水 20 μl，干燥后备用。

    1.3.3   试验菌的接种用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3 次。每涂抹1 次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹1周。盖好平皿，置室温干燥 5 min。

    1.3.4   抑菌剂样片贴放每次试验贴放1 个染菌平板，每个平板贴放4 片试验样片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25 mm 以上，与平板的周缘相距 15 mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16～18 h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。试验重复3 次。

    测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。 测量其直径应以抑菌环外沿为界。

    1.4   评价标准规定 抑菌作用的判断:抑菌环直径大于 7 mm 者，判为有抑菌作用；抑菌环直径小于或等于7 mm 者，判为无抑菌作用。

    1.5   抑菌结果见表1。表1  左金丸提取液抑菌结果

    1.6   小结左金丸提取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用，按抑菌环的大小判断，对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌。抑菌环的大小顺序为：半仿生提取液>水提液>醇提液，可见左金丸3种提取液的抑菌效果为：SBE液> WE液> AE液。

    2  抗炎实验

    2.1  动物昆明种小鼠，由山东大学试验动物中心提供，许可证号SCXK（鲁）20030004。

    2.2   仪器JY2001型天平，上海精密仪器有限公司生产；AE100S电子天平，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司生产。

    2.3   阳性对照药布洛芬片，0.2 g/片，批号0502166，山东新华制药有限公司生产。

    2.4   统计方法实验数据以±s表示，组间差异的显著性检验采用t检验（SAS 8.0软件）进行。

    2.5   方法取健康无伤的22～25 g 昆明种小鼠110只，雌雄各半，按体重、性别随机分为11组，10只/组，雌雄各半，设立空白对照组和阳性对照组，三个剂量的“1.2”项下左金丸三种供试液（1.15，2.3，4.6 g/kg），给药容积为0.1, 0.1, 0.2 ml/10  g，阳性对照药布洛芬片（0.1g/kg），给药途径：口服灌胃。空白对照组灌胃等容积的蒸馏水，连续灌胃2 d(1次/d)。末次给药1 h 45 min后于小鼠右耳涂二甲苯20 μl/只，25 min后处死动物，以直径7 mm的打孔器打下小鼠左右耳两侧同部位的耳片，精密称重，肿胀度和肿胀抑制率。

    肿胀度(mg)= 右耳重(mg)- 左耳重(mg)

    肿胀抑制率（%）=（空白对照组肿胀度-给药组肿胀度）/空白对照组肿胀度×100% 

    2.6  结果见表2。

    2.7  小结与空白对照组相比，左金丸高剂量组、中剂量组的3种提取液均对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著抑制作用，差异有非常显著性意义（P<0.01）；3种提取液对小鼠耳肿胀的肿胀抑制率大小顺序为：SBE液> WE液> AE液。

    与空白对照组相比，左金丸低剂量组的半仿生提取液对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著抑制作用，差异有非常显著性意义（P<0.01）；水提取液和醇提取液对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制无统计学意义（P>0.05）；3种提取液对小鼠耳肿胀的肿胀抑制率大小顺序为：SBE液> WE液> AE液。

    左金丸提取液对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著抑制作用，肿胀抑制率大小顺序为：SBE液> WE液> AE液。表2  左金丸对小鼠耳肿胀的影响

    t检验：与空白对照组比较，* P<0.05, ** P<0.01；n=10

    因此，左金丸方药的3种提取液的抑菌、抗炎作用大小顺序为：SBE液> WE液> AE液。

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  ［1］ 朱设敏,匡 荣,薛 冬,等.妇宝颗粒的主要药效学研究［J］.应用药学杂志,2004,21（3）:176.

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［3］ 汤长鸣,李 军,庞晓东.雷公藤与苦参配伍的体外抑菌试验［J］.实用医药杂志,2003,20（2）:158.

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