反相高效液相色谱法测定野菊花中蒙花苷的含量
作者：王伯涛 王锋 张同波 王惠民
【摘要】 目的建立野菊花中蒙花苷的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，在室温下，C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-水-冰醋酸（52∶46∶2）为流动相；检测波长334 nm。结果蒙花苷的线性范围0.05～2.5μg，r = 0.999 9（n=10）；平均回收率99.2%，RSD＝2.4%（n＝6）。结论 该法可作为野菊花药材的质量评价方法。
【关键词】 野菊花； 蒙花苷； 含量测定； 高效液相色谱法
Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of the content of linarin in Flos Chrysanthemi Indici by RP?HPLC．MethodsThe chromatographic condition included a C18 column （250 mm×4.6 mm，5μm）and the mobile phase consisting of methanol-water-acetic acid glacial（52∶46∶2）and the absorbance was monitored at 334nm．ResultsThe calibration curve was linear over the range of 0.05～2.5 μg for linarin，r = 0.999 9（n = 10）．The average recovery was 99.2％（n = 6）and the RSD was 2.4％．ConclusionThe method can be used for the quality control of Flos Chrysanthemi Indici．
Key words：Flos Chrysanthemi Indici； linarin； Content determination； RP?HPLC
野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L. 的干燥头状花序，性微寒、味苦辛，归肝、心经。功能清热解毒，主治疔疮痈肿，目赤肿痛，头痛眩晕。野菊花主含黄酮类化合物，并以蒙花苷的含量最高［1～5］。在《药典》（2005年版）修订起草时，笔者建立了RP-HPLC法测定其中蒙花苷含量的方法，取得了满意的效果。由于现版药典《起草说明》未能公开发行，故而将有关研究结果报道如下，以供。
1 器材
VARIAN高效液相色谱仪，Pro Star 215泵，Pro Star 410自动进样系统，Pro Star 310检测器，Varian Star 5.5色谱工作站。Shimadzu高效液相色谱仪，LC?10AD泵，SPD -10A检测器，美国Ana Star 色谱工作站。Hanbon-7 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：江苏汉邦科技有限公司；DiamonsilTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。VARIAN CARY 50 Probe紫外分光光度计，Cary Win UV色谱工作站。METTLER AG 135、AB 204－N天平。YB－Z真空恒温干燥箱：天津药典标准仪器厂。
流动相用甲醇、乙腈为色谱纯，水为注射用水。试药均为分析纯。试液按《中国药典》2000年版Ⅰ部附录方法配制，一般溶液按常规方法制备。
野菊花对照药材（0995?200002）、蒙花苷对照品（1528-200101）：中国药品生物制品检定所。
野菊花药材为全国各地药检所提供的商品药材样品及中国药品生物制品检定所标本馆馆藏标本。
2 方法与结果
2.1 实验条件的选择
2.1.1 回流提取时间取本品粗粉1 g，置500 ml烧瓶中，加甲醇200 ml，加塞，称定重量。水浴加热回流30 min（从沸腾起开始记时，下同），立即于冷水中冷却，密塞，称定重量，用甲醇补足减失的重量。摇匀，密塞，放置5 min。吸取上清液5.0 ml于大小适宜的容器中，作为样1，密塞备用。原溶液密塞，称定重量。再于水浴加热回流30 min，如法操作，循环5次，分别获得样2 ～样5，密塞备用。
上述实验重复4次。得：样1?1 ～ 样1?5、……、样4?1～ 样4～5，共20份试样。各试样微孔滤膜(0.45 μm)过滤，弃去初滤液，收集续滤液照“2.9样品测定”项下方法测定蒙花苷峰的峰面积。
各实验以第5份试样（最后一次取样）的峰面积为100%，分别第1至第4份试样的峰面积百分数。见表1。
取4次实验均值，以时间为横坐标，峰面积百分数为纵坐标作曲线图。见图1。
表1 回流提取时间与提取率（略）
图1 回流提取时间与提取率曲线（略）
图2 流动相中蒙花苷UV吸收光谱（略）
由图1，表1可知，样品回流提取至第5次、回流提取时间总计达到2.5 h时，蒙花苷的浓度基本不再增加，即可认为提取完全。为确保充分提取，供试品溶液的回流提取时间拟定为3 h。
2.1.2 色谱条件
2.1.2.1 检测波长取上述蒙花苷对照品溶液，加流动相稀释至适宜的浓度。以流动相为空白，在400～250 nm范围内扫描吸收光谱。见图2。
由图2可知，蒙花苷在流动相中最大吸收波长为334 nm。所以测定时检测波长选择334 nm。
2.1.2.2 流动相实验了以下几种流动相系统：①乙腈?水?冰醋酸（40∶59∶1）、（20∶79∶1）、（25∶73∶2）；②甲醇?水?醋酸（45∶54.5∶0.5）［6］；③甲醇?水?冰醋酸（45∶54.5∶0.5）、（45∶54∶1）、（45∶53∶2），（52∶46∶2）。
其中以乙腈?水?冰醋酸（25∶73∶2）、甲醇?水?冰醋酸（52∶46∶2）分离效果较好，但考虑蒙花苷的检测波长为334 nm，使用乙腈流动系统试验成本较高，因此，选定系统后者作为本含量测定的流动系统。
在选定的系统中样品分离效果见图3。
a-蒙花苷对照品 b-野菊花对照药材 c-野菊花样品（编号2）
图3 野菊花HPLC分离效果图（略）
2.1.2.3 柱温在其它条件均同情况下，用同一色谱柱分别在20，25，35，45，50℃柱温下进样，得不同柱温时的色谱图。见图4。
在不同温度下色谱柱的理论板数和分离度见表2。
表2 温度对柱效的影响（略）
由图4，表2可知，降低柱温，可增加柱效，提高分离效果，但分析时间延长。适当地升高柱温，有利于提高分析速度并降低柱压，但分离效果有所降低。
本实验的柱温选择为35℃。在缺少柱温箱时，可以在室温下进行测定。
2.2 专属性（选定条件下的三维色谱）在“2.1”项选定的实验条件下，用二极管陈阵列检测器记录供试品溶液的三维色谱，见图5。可知，蒙花苷峰纯度好，无杂质干扰。
2.3 系统适用性实验
2.3.1 理论板数、分离度、对称因子在“2.1”项选定的实验条件下，测定了8个样品，其中一个样品重复测定5 次，结果见表3。
由表3可知，样品的理论板数均在3 000以上，分离度均在2.0以上。虽然对称因子略大于1.05，但本方法并不以峰高计算含量，可以满足分析要求。
2.3.2 重复性精密吸取蒙花苷对照品溶液（0.025 mg/ml）20 μl，连续进样5次，照含量测定项下条件测定峰面积，计算RSD＝0.18%，远远小于《中国药典》中2.0%的规定。
图4 不同柱温时野菊花的HPLC色谱图（略）
表3 理论板数、分离度、拖尾因子（略）
表中数据皆为均值；样品含量范围 0.5%～ 3.5%
2.4 线性试验分别精密吸取蒙花苷对照品溶液（5 μg/ml）10，20，30，40，50 μl，蒙花苷对照品溶液（50 μg/ml）10，20，30，40，50 μl注入液相色谱仪，测定蒙花苷峰面积，以蒙花苷的进样量为横坐标，蒙花苷峰面积为纵坐标作图，得一过原点的直线。回归方程：
Y＝1.057×106X － 1.86×104［0.05≤X ≤2.5 /μg］。
线性范围：0.05～2.5 μg
相关系数：r = 0.999 9 (n=10)。
2.5 供试品溶液稳定试验照“2.9样品测定”项下方法制备供试品溶液，立即测定蒙花苷浓度，以后分别于第一次测定后6，12，24，48 h时各重复测定1次，计算RSD＝0.81%。
2.6 加样回收率试验分别精密吸取蒙花苷对照品溶液（0.05 mg/ml）35，30，25 ml置250 ml烧瓶中，减压蒸干。依次精密加入供试品0.075，0.1，0.125 g，分别照“2.9样品测定”项下方法，自“精密加入甲醇100 ml”起，如法操作，回收率。结果见表4。
2.7 方法重复性取同一供试品，照“2.9样品测定”项下方法同时测定6份，结果RSD＝±1.23%（n＝6）。
表4 加样回收率实验（略）
a-蒙花苷对照品 b-野菊花药材
图5 选定条件下的三维色谱（略）
2.8 耐用性试验
2.8.1 温度（柱温）取同一供试品溶液分别在25℃，35℃，45℃温度（柱温）下测定含量，结果分别为（mg/ml）：0.069 4，0.069 3，0.069 7（为两次进样的平均值，下同），可见在25℃～45℃范围里，温度对测定结果没有明显影响。
2.8.2 色谱柱（不同色谱柱的比较）用3根不同品牌的色谱柱，在相同的条件下对同一供试品溶液进行测定，结果分别为（mg/ml）： 0.0679（汉邦）、0.0693（迪马）、0.0711（Lichtospher，分离效果未能达到《药典》要求）。
2.8.3 流动相比例在不改变流动相组分的情况下，适当改变流动相各组分的比例对同一供试品溶液进行测定，结果见表5。
表5 不同流动相配比时的测定结果（略）
2.8.4 检测波长取同一供试品溶液，如法测定，但检测波长分别用 325，335，345 nm，结果见表6。
表6 不同检测波长下的测定结果（略）
2.9 样品测定 色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇－水－冰醋酸（52∶46∶2）为流动相；检测波长为334 nm。理论板数按蒙花苷峰计算，应不低于3 000。
对照品溶液的制备：精密称取50℃减压干燥（在P2O5干燥剂存在下）至恒重的蒙花苷对照品适量，加甲醇使溶解（必要时加热）并制成每ml含蒙花苷0.025 mg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品50 g，粉碎，过3号筛，混匀。精密称取约0.25 g。置250 ml锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，加塞，称定重量。水浴加热回流3 h，放冷，密塞，称定重量，用甲醇补足减失的重量。摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，弃去初滤液，收集续滤液即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
所收集样品，含量测定结果见表7。
表7 干燥野菊花各样品含量（以干燥品计算）（略）
*中检所馆藏标本，编号：337051，1970-1-1中国药材公司赠；**中检所馆藏标本，编号：337007，（1971-11收集）；***中检所馆藏标本，编号：337003，（1959收集）；****中检所馆藏标本，编号：337011
3 讨论
方法学验证表明，在实验条件下，用RP- HPLC法测定野菊花中蒙花苷的含量，其色谱系统能够适应测定需要，分离度、重复性试验能够满足药典要求。样品重复性实验、样品溶液稳定性、加样回收率、耐用性实验结果均很满意。
在耐用性实验中我们发现，某些品牌的色谱柱分离效果较差，甚至不能实现蒙花苷的完全分离。因此在样品测定前应进行预试验以确定色谱柱的性能是否能够满足测定要求，能否达到中国药典的有关规定。另外，温度对色谱的分离度具有一定的影响，在本方法测定条件下，适当降低温度对分离有利。
蒙花苷对照品具有吸湿性，临用前需进行干燥。本试验在P2O5干燥剂存在下、50℃减压干燥12 h。 蒙花苷对照品在甲醇中的溶解度较小，必要时可加热溶解。
流动相中冰醋酸不仅具有调节pH的作用，也作为流动相的重要组分，用量的多少，对主成分峰与杂质峰的分离具有较大的影响。
本研究虽未对野菊花药材中蒙花苷的稳定性进行实验，但根据中国药品生物制品检定所标本馆标本（标本编号337003，收集时间1957年）的测定结果（2.6%）来看，推测蒙花苷在野菊花药材中具有非常好的稳定性。
野菊花中蒙花苷的含量差异很大，根据本研究所收集样品的测定结果，范围在0.06%～3.6%之间，高低相差50倍以上。这也说明了测定野菊花中蒙花苷含量的重要性和必要性。
在测定的19份样品中，明确产地的有14份。以蒙花苷的含量为指标，对已知产地的样品进行了简单统计，见表8。
表8 不同产地野菊花蒙花苷的含量（略）
由表8可知，来自各地野菊花药材中，以江苏产野菊花药材蒙花苷的含量最高，平均为2.61%。在明确产地的14个样品中有4个样品来自江苏（其中包括1个贮存了近50年的样品），这4份样品的蒙花苷含量无一例外地超过了2.0%。而其它产地的样品，其蒙花苷含量均在2.0% 以下。尽管有些产地的药材样品只有一份，其测定结果不能代表当地药材的质量，但不能否定来自江苏的4个样品的测定结果具较高的价值。本研究结果佐证了传统认为江苏产野菊花为道地药材是具有一定依据的。
致谢：感谢中国药品生物制品检定所标本馆徐继民老师、江苏省药品检检所刘舞霞老师、南京中医药大学郭立玮教授提供野菊花样品。
【参考】
［1］ 郑虎占.中药研究与应用（第六卷）［M］.北京：学苑出版社，1999：5858 .
［2］ 陈政雄，钱名堃，曾广方，等.中药黄酮类的研究Ⅷ.野菊花成分的研究（第一报）［J］.药学学报，1962，9（6）：370.
［3］ 沈一行,权丽辉，关 玲，等.北野菊黄酮类成分研究［J］.药学学报，1997，32（6）：451.
［4］ 钱名堃，陈政雄，曾广方.野菊花成分的研究（第二报）［J］.药学学报，1963，10（3）：129.
［5］ 于德泉，谢凤指.野菊花成分的研究［J］.药学学报，1987，22（11）：837.
［6］ 王伯涛，鲁 静，林端超.RP-HPLC法测定野菊花栓中蒙花苷的含量［J］.中成药，2007，29(7)：附9.
