微波辅助萃取－分光光度法测定细梗胡枝子叶中总黄酮的含量
作者：张帆，齐小花，邹明强，解瑞丽，李锦丰，杨屹，张宏桂
【摘要】 目的采用微波辅助萃取法提取，以分光光度法测定细梗胡枝子叶中的总黄酮含量。方法单因素法优化微波提取条件为：使用75%乙醇，在液固比70 ml/g下，加热至75℃后持续辐射15 min。结果与传统的乙醇浸提法和超声法相比，微波法具有操作简便，可靠，重现性好等特点。结论微波法适合推广应用于各类中草药中总黄酮含量测定的样品前处理。
【关键词】 微波辅助萃取 分光光度法 细梗胡枝子 总黄酮
Abstract：ObjectiveTo extract total flavones from Lespedeza virgata (Thunb.) DC. by microwave-assisted extraction and determine its content by absorption spectroscopy. Methods The extracted conditions of flavones were optimized as 70 ml/g of 75% ethanol to leaves weight ratio and solution temperature of 75℃ for 15 min. ResultsCompared with moceration and ultrasonic-assisted extraction, microwave-assisted extraction was simple and accurate with good reproducibility. Conclusion It is suitable for the determination of flavone in many kinds of traditional Chinese medicines.
Key words：Microwave-assisted extraction (MAE); Absorption spectroscopy; Lespedeza virgata (Thunb.) DC.; Flavones
胡枝子属植物含黄酮、生物碱、萜类、甾醇、有机酸、鞣质等多种化学成分［1～6］，有抗炎、抗过敏、抗早孕、镇痛等药理活性，特别是黄酮类化合物对肾功能不全的作用尤为显著。细梗胡枝子为豆科植物细梗胡枝子Lespedeza virgata (Thunb.) DC.的干燥全草，可用于治疗慢性肾小球肾炎、肾盂肾炎、肾结核及肾萎缩等疾病。药研究表明，该药所含的多种黄酮类化合物能降低血中残余氮，改善肾功能，影响离体子宫的作用，此外还具有抗炎、抗早孕、抗过敏及止痛等作用［6］。
自Ganzler［7］首次将微波辅助技术（microwave-assisted extraction，MAE）应用于植物样品提取以来，MAE在天然植物提取中的应用越来越受到重视［8～14］。本文仅就该项技术应用于细梗胡枝子中黄酮类化合物的提取进行研究，并用分光光度法对总黄酮含量进行测定，建立了细梗胡枝子叶中总黄酮的微波辅助萃取－分光光度测定法。现报道如下。
1 仪器与试剂
XH-100A型祥鹄电脑微波催化合成/萃取仪（祥鹄科技有限公司），具有温度控制部件，设计温度±1℃。U-3010/3310分光光度计（天美科技有限公司）。
细梗胡枝子（购自湖南省沅陵县）；芦丁标样（药品生物制品检定所）；乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 样品的处理
先将细梗胡枝子叶粉碎后过60目的筛子，之后用烘箱烘至恒重保存。准确称取1.0 g细梗胡枝子粉于圆底烧瓶中，按要求加入一定量的乙醇，控制一定温度，在一定的微波功率下微波萃取一定时间，过滤，定容，取一定量试液进行显色、测定。
2.2 总黄酮含量的测定
在10 ml容量瓶中，取少量样品溶液，依次加入若干毫升的NaNO2溶液，Al(NO3)3溶液和NaOH溶液，然后用乙醇溶液定容至10 ml，于室温下放置10 min，用1 cm比色皿，以试剂空白为参比，在选定波长下测定其吸光度［15，16］。根据标准曲线求得总黄酮的提取率，其公式为：提取率(mg/g)＝X×V/m，其中X是从标准曲线上查得的浓度值，V为萃取液体积，m为细梗胡枝子叶的质量。
3 结果
3.1 测定波长的选择取适量总黄酮萃取液进行显色反应，用分光光度计对其红色产物在400～700 nm之间扫描，在510 nm处有最大吸收，所以确定510 nm为测定波长。
3.2 显色反应时间的确定准确吸取一定量样品溶液，按照实验方法在0～60 min范围内，每隔5 min测定其吸光度考察反应体系的稳定性。由实验结果可以看出，黄酮显色产物在前30 min内吸光度基本不变，但在30 min后，吸光度开始略有下降，因此其吸光度应控制在定容后前30 min内测定。
3.3 标准曲线的建立精确称取芦丁标准品10 mg，用75%乙醇水溶液定容至100 ml容量瓶中，配好冷藏放置于冰箱中。分别取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml标准液于10 ml容量瓶中，分别加入一定量的75%乙醇水溶液稀释成5.0 ml。加入5% NaNO2溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min；再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 ml，摇匀，再放置6 min；加4%的NaOH溶液2.0 ml，用水稀释至刻度，放置10 min，在分光光度计上，以试剂空白为参比于510 nm处测其吸光度，得到回归方程为：A= 11.7C-0.004 7( r =0.999 7)，式中A为吸光度，C为溶液中芦丁的浓度(g/ml)。该方程在所测范围内(5～25 g/ml)线性关系良好。
3.4 微波辅助萃取法的单因素实验
3.4.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响
本文用乙醇溶液作为提取体系，考察了乙醇浓度对微波萃取细梗胡枝子叶中黄酮类物质的影响，结果见图1。由图1可见，总黄酮提取率随乙醇浓度的增大先呈上升趋势，在乙醇浓度为75%时达到最大，之后乙醇浓度再增大时，提取率呈下降趋势，因此考虑选75%乙醇作提取剂为宜。
3.4.2 液固比对黄酮提取率的影响
在其他条件相同下，不同溶剂用量对黄酮提取率的关系如图2所示。从图2可知，提取率随着液固比的增大而呈上升趋势，但增大到70 ml/g后就趋于下降，之后实验中选择液固比为70 ml/g。
3.4.3 溶液温度对黄酮提取率的影响
在其他条件相同下，得黄酮提取率与溶液温度的关系，见图3。由图3可知，75℃以前总黄酮提取率随功率增加呈现上升，75℃后开始下降。因此实验中溶液温度最好控制在75℃。
3.4.4 微波辅助提取时间对黄酮提取率的影响
在其他条件相同下，考察了黄酮提取率与微波辅助提取时间的关系，见图4。由图4可知，提取率随微波辐射时间的增加而呈现先增加后下降的趋势。从时间效益考虑，微波时间应控制在15 min。
3.5 最佳条件下的重复性和回收率实验
3.5.1 重复性实验
取同一批细梗胡枝子叶样品5份，在最佳条件下进行萃取，分别测定各自的总黄酮含量，结果表明其相对标准偏差为1.79%。
3.5.2 加样回收率实验
准确称取一定量样品9份，加入不同量的芦丁对照品溶液在相同微波条件下进行萃取，萃取物按实验方法进行显色，测定吸光度，回收率，结果表明回收率在99%～102%之间，说明此方法有较好的准确度。
3.6 微波法与乙醇浸提法及超声波萃取法的比较
本实验应用了乙醇浸提法和超声波萃取法进行对比实验。乙醇浸提法：温度75℃，乙醇浓度75%，液固比35 ml/g，连续提取2次，第1次3 h，第2次3 h，平均提取率为18.4 mg/g。超声波提取法：100 W微波功率，超声波萃取30 min，乙醇浓度75%，液固比70 ml/g，平均提取率为20.1 mg/g。以上各种萃取方法结果对比列于表1中。由表1可以看出，微波法仅用15 min却比乙醇浸提6 h的提取率高出1.4倍，比超声波提取法高出1.3倍。从节能、省时和试剂消耗等多方面角度来看，微波法优于乙醇浸提法和超声波提取法。表1 样品分析结果（略）
4 结论
本文主要对微波辅助萃取法萃取细梗胡枝子叶中总黄酮进行了初步研究，由重现性实验和加样回收实验的结果可以看出，本文建立的萃取方法和测定方法可靠，准确，简便。微波辅助萃取与乙醇浸提法的比较表明，微波辅助萃取法具有快速、提取率高、溶剂用量少等特点。本法操作简便，结果可靠，重复性好，稳定性好，可广泛用于各种中草药中黄酮类物质含量的测定。
【】
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